现代生命科学与生物技术-合成生物学

合成生物学化学化工学院黄磊现代生命科学与生物技术硕士研究生公共课程第4章合成生物学4.1概述4.2生物元器件4.3DNA的合成与元器件装配4.4合成生物的功能实现4.1概述•4.1.1合成生物学的概念•4.1.2合成生物学的发展•4.1.3合成生物学的应用4.1.1合成生物学的概念•包括人类在内的700多种生物的基因组已经被测序，在分子水平上研究基因的结构和功能成为现实•合成生物学（syntheticbiology）是基于生命系统的工程技术，旨在设计、构建自然界不存在的生命或使已存在生命具有新功能•合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命相关背景合成生物学是继人类基因组计划研究之后，生物领域的又一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现合成生物学是生物发展到一定阶段随之工程化的必然趋势科学家希望能够设计新生物体来满足一些特殊需要:–让细菌吃进纤维素废物，排泄出石油–把“生物砖”类比于半导体工业中的半导体元件，组装这些元件，让细胞干我们想让它干的事情–采用基因工程方法将生物细胞“组装”成实用的机器或技术合成生物学与计算机工程的层次比较4.1.2合成生物学的发展•合成生物学是按照需要设计制造出具有不同性状的基因，再将这些基因集成到细胞中，形成具有特殊功能的人造生命•1911年7月8日，《柳叶刀》出现“合成生物学”一词•2000年以后，这一学科迅速发展，大量科学家将注意力转向该领域•2004年MIT出版的TechnologyReview，将合成生物学评为“将改变世界的十大新技术”之一合成生物学国际会议•2004年6月：美国MIT，第1届，SB1.0•2005年5月：美国UC-Berkeley，第2届，SB2.0•2007年6月：瑞士，第3届，SB3.0•2008年10月：香港，第4届，SB4.0•2008年5月，北京香山“合成生物学学术研讨会”——合成生物学＝下一代的生物技术合成生物学的标志性进展•长片段DNA合成技术：2004年•染色体移植技术：2007年•染色体组装技术：2008年1月，美国克雷格·文特研究所人工全合成生殖支原体细菌完整染色体（已知的自然界中基因组最小的生物体：485个基因，58万个核苷酸；人类：10万个基因，30亿碱基对）•“很多技术曾被视为对上帝的挑战，但恐怕没有一个像合成生物学一样，要面对直接的谴责”，《自然》杂志2007年写道：“上帝第一次有了对手”——达尔文式的自然进化世界将被人造世界所取代合成生物学为很多领域的研究提供新视角•生物学家：重建不同层次的研究对象，由此加深对生命活动和生命过程的理解•化学家：创造新分子化合物•物理学家：发现自然状态下分子的活动行为•工程技术科学家：进行药物、生物材料和生物能源等工程设计与简单、低廉、高效的制造，满足人类和社会发展的需要合成生物学与系统生物学•合成生物学的出现与系统生物学（systemsbiology）的发展密不可分；都遵从系统论，对生物系统的整体功能进行研究•系统生物学将在基因、蛋白质、代谢物等多维分子水平获得大量的细胞行为知识和建立生物网络，为合成生物学提供理论和模型•合成生物学可为系统生物学的定量分析提供模式生物合成生物学与生物信息学、化学•基因组测序是遗传信息阅读和解码的过程，合成生物学是测序的逆过程•合成生物学对生物信息学（bioinformatics）提出了更大的挑战，其设计和优化需要新的算法进行模拟和测试•合成生物的过程是以原料核酸的高速合成为基础的，需要高效、低成本的化学合成技术提供支持•目前常规化学方法合成一个碱基核苷酸的商业化价格是2元左右，新方法有望降低成本合成生物学与基因工程•都以基因为操作对象，都需要核酸酶和连接酶作为剪切和组装的工具，都需要载体来承载基因，进行扩大繁殖和保存•基因工程技术只能在较小的范围内对已经存在的生命进行改造•合成生物学能够将分解的数个功能模块高并行合成并构建代谢电路，最终得到具有复杂功能的新生命•合成生物学研究将降低关键技术成本，解决基因操作的经济性问题，在工程领域得到广泛应用•美国麻省理工学院的TomKnight一语道破了基因工程的困境：“由于缺乏标准化的DNA序列组合技术，使得每一次DNA组合反应既是解决研究题材的工具，本身也是一项实验”•生物工程使用的方法和零件如果能够标准化，就能建立相容组件的设计库。观念与制造分开后，生物工程学家才有余力去构思更复杂的装置，利用更有效的工具（电脑辅助设计）来控制系统的复杂度4.1.3合成生物学的应用•合成生物学的目的是工程应用而非科学研究，它吸引了更多的工程专家、信息专家共同研究•合成生物学的核心观念是，认为生命的所有零件都能由化学方法来合成制造，进而通过工程化方式组装成实用的生命•合成生物学的研究和实验仍然处在初级阶段合成生物学的应用领域•生物医药领域：改造细胞，生产新型药物；重新设计更有效、更安全的生物治疗方法•生物能源与新材料领域：重新设计生物质路线图，获取太阳能、清洁燃料和新能源，可降解塑料、碳纳米管等材料•环境领域：设计和合成新功能微生物，用于清除水污染、清除垃圾、处理核废料等•智能计算机与生物传感领域：生物机体的实时检测，细胞机器人在动脉中检测并清除导致血栓的动脉粥样硬化物质，探测化学和生物危险物和爆炸物的生物警报器4.2生物元器件•4.2.1合成生物的单元•4.2.2合成生物的设计与优化4.2.1合成生物的单元—基因元件与生物砖•基因（生物）元件（geneticelement）：是具有某种特定的生物学功能的DNA或RNA，是设计和合成生物的基本单位•特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境•可以是功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇•也可以是界面调控元件：包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因，如复制子、启动子、阻遏子、诱导子、转录因子、核糖体结合位点、转录终止子、翻译终止密码、酶切位点、选择标记等部分基因元件及其对应的的图示生物部件生物部件（biologicalpart）是由一个或多个基因元件组成，最简单的能行使催化功能的生物部件，是完整的编码酶基因表达盒生物砖生物砖（biobrick）是标准化的基因元件，是具有可连接性末端（前后缀）的基因元件–前后缀分别是两个核酸限制性酶切位点，该末端只能用于元件之间的连接–前缀之后依次是测序引物、启动子、核糖体结合位点、功能基因、翻译终止密码、转录终止子4.2.1合成生物的单元—生物模块与基因电路生物模块（biologicalmodule）是一组细胞内区域化的生物器件（biologicaldevice），它们由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能–细胞内模块往往是具有特定功能的途径，如代谢途径、信号转导途径、调控途径等–模块可以由生物砖通过某种逻辑关系构建而成，但功能必须完全清楚与电子科学中的电路类似，在合成生物学中，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因电路（geneticcircuit）–代谢途径模块可由代谢电路来执行，调控途径可由调控电路来完成–基因电路可清楚地图示生物模块的物理结构和生物功能–基因电路特点是：具有定量特性，有确定的应答阈值及明确的反应边界，生物砖容易被除去、替换、更改；还可实现非自然的功能4.2.2合成生物的设计与优化针对复杂生物系统，合成生物学设计的工程策略：–标准化：是确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述；从系统生物学的角度，对基因组序列进行分门别类有助于定义生物功能–解耦联：是把复杂问题简单化的过程，把复杂系统解分成具有独立功能的简单组分，把设计和装配分开，以便完成设计后，能有效装配成整体系统–抽提：是建立元件和模块的层阶，分开和限制各阶层之间的信息交流，隐藏生物信息和管理的复杂性，形成简化的再设计的器件和模块，建立可识别界面的元器件库生物砖的设计与优化•生化反应的高度抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因，即一个生物砖•生物砖功能的运行模式：基因表达调控的操纵子模型，最小包括启动子、核糖体结合位点、生化反应功能基因、终止子；对于复杂的生物元件，赋予调控序列如增强子、衰减子、扩增子等•生物砖的优化：对功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点进行优化，使之适应于宿主中的高表达基因电路的设计与优化•生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能•基因电路设计与合成中最大挑战是如何优化，使基因电路实现相应的生物功能•优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化–理性设计：生化反应建模–元件进化：改变元件特性，包括碱基突变、改变转录和翻译动力学、操纵子的亲和力、转录因子的共结合活性等，关键在于对基因电路进化行为的筛选和效果的评价方法–理性设计和直接进化的结合，是基因电路设计和优化的最佳策略4.3DNA的合成与元器件装配•4.3.1基因定向突变合成技术•4.3.2核酸的全化学合成•4.3.3生物砖的合成与基因电路的集成•4.3.4基因组的合成与装配PCR——把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。PCR法，又称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。PCR反应系统中应包括下列成分（1）cDNA文库，内含目的基因DNA片段。（2）两条探针，分别与目的DNA的正链或负链的3’末端互补。（3）DNA聚合酶通常用TaqDNA聚合酶（高温）PCR反应分三步完成：第一步——90度高温下，使混合物的DNA片段因变形而成单链。第二步——50度温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片段上。第三步——70度温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。PCR的三个步骤为一次循环，约需5-10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过30次循环，即可扩增109倍，总共只需几个小时。4.3.1基因定向突变合成技术•基因突变是指DNA序列中碱基排列顺序的变化，包括点突变、易位、倒置、插入、缺失等•合成生物学研究中，采用PCR技术，通过序列的定向突变，可以实现对原始基因序列优化，合成新的基因功能、基因转录调控区等，从而满足生物元件的设计要求•主要包括重叠延伸PCR定点突变合成、大引物扩增PCR定点突变合成和片段PCR连接合成•重叠延伸PCR定点突变合成–4种引物，3轮PCR–优点：突变体回收率高，可在任何位点引入突变，快速简便–缺点：错误率高，不能有效扩增大片段•大引物扩增PCR定点突变合成–3种引物，2轮PCR–正反向引物具有显著不同的Tm值–突变效率高，避免了两轮PCR之间的纯化步骤•片段PCR连接合成–多处需要突变–将基因分为等长、重叠的片段，然后PCR扩增性连接4.3.2核酸的全化学合成•大片段核酸的合成非常重要，是实现合成生物的关键技术•大片段核酸的合成，先化学合成寡核苷酸，然后片段PCR扩增连接合成全长基因•国际上的三家商业化公司，BlueHeronTechnology、DNA2.0和GENEART，提供数千碱基DNA的合成业务•程序化的微芯片合成DNA是一种非常吸引人的技术，可望取得突破性进展DNA的化学合成•基本原理：多步连续反应，固相亚磷酰胺三酯法，方向：3’－5’，先保护不参与反应基团、缩合反应之后再选择性脱除以形成专一的磷酸二酯键，单体为核苷亚磷酰胺•合成反应步骤：脱保护（DMT），活化（H＋），连接，封闭，氧化（三价P-五价P）•合成后处理：切割（3’-OH），脱保护基（DMT），纯化（C18，OPC柱，PAGE，HPLC），定量（OD260）•溶解和保存：-20℃DNA的传统全化学合成原理4.3.3生物砖的合成与基因电路的集成•MIT的标准生物元件库（RegistryofStandardBiologicalParts）已有2000个生物砖•生物砖的标准化操作——为了