新型壳聚糖修饰纳米硅作为水难溶性药物卡维地洛口服缓释载体的研究

题目：新型壳聚糖修饰球状纳米硅作为水难溶性药物卡维地洛口服缓释载体的研究摘要：制备一种新型球状纳米硅（SNM）和壳聚糖修饰球状纳米硅（CTS-SNM）以进行利用壳聚糖调节药物从多孔硅的释放速率及制备口服缓释药物载体的可行性研究。为实现此目标，我们合成了球形纳米硅基质（SNM）和表面连有壳聚糖链的球形纳米硅基质（CTS-SNM）。使用溶剂蒸发法将药物卡维地洛分别包进SNM和CTS-SNM中。采用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、氮吸附、X射线衍射（XRD）、差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TGA）等方法对药物载体和载药复合物的理化性质进行系统研究。研究发现了，在模拟胃肠液中CTS-SNM结构发生改变药物体外释放行为与壳聚糖的溶胀作用两者间的关系。并且我们还进行了药代动力学和生物利用度方面的研究。结果表明，造成药物缓释的两大主要因素是：SNM的强分散效应和由于壳聚糖溶胀产生的阻塞效应。壳聚糖在酸性环境下具有溶胀性在相对碱性环境下具有收缩性，这使得壳聚糖在模拟胃肠液中可调节药物的释放。体内实验显示：利用SNM为药物载体时，卡维地洛（CAR）的生物利用度比商业胶囊的提高了182%。CAR-CTS-SNM与商业胶囊相比，CAR的药峰时间推迟了3.4h且生物利用度有轻微的提高。我们认为此次对于SNM和CAR-CTS-SNM的研究将有助于提高聚合物和无机材料在药物方面的应用，并且可以带动水难溶性药物的缓释、速释口服药物传递系统的设计。关键字：纳米硅，壳聚糖，药物传递，缓释，水难溶性药物，卡维地洛引言纳米技术的最新进展为我们提供了许多形状、大小高度可控的纳米材料，以及许多有趣的性质。这些材料有许多生物医学方面的应用，从疾病的诊断到新型疗法的开发。特别是由于二氧化硅表现出的优异的物理性能和表面易修饰性，介孔二氧化硅的发现被认为是材料科学研究的一个里程碑，全世界都在关注于使用二氧化硅作为一种有效的制剂方法并通过对其表面进行功能化修饰以提高水难溶性药物的溶出率及调节药物的释放。到目前为止，除了已确定的系列纳米硅材料如MCM或SBA型，我们团队已开发出一系列应用于制药领域的具有多种形态和孔隙结构的新型纳米二氧化硅基质，如：球形介孔二氧化硅纳米粒、介孔泡沫二氧化硅纳米粒和3D大孔二氧硅。但是，先进的药物传递系统需要更加精确的药物载体以应答生物及环境的刺激从而调节药物的释放及吸收性能。因此，我们做了许多努力来探索一种具有理想性质的新型药物载体以实现所谓的智能药物传递，例如靶向或缓释药物传递系统。在这篇文章中，如何将二氧化硅的良好性能与所需的新型药物传递系统结合起来是所有致力于药物传递系统研究的科学家们的一个新课题。众所周知，对许多药物来说粒径的减小可以增加其溶解速率，这一方法在制药企业中已使用了许多年。不同于传统的通过表面活性剂或聚合物固定药物颗粒制备纳米制剂的方法，介孔二氧化硅可以将药物保持在大小范围在2-50nm的较小空间内，并且可以使药物有效分散并处于一种无定形或微晶状态。同时，二氧化硅的刚性多孔结构为具有更高自由能和更大分子运动性的药物纳米粒子提供了更加稳定的环境。毋庸置疑，使用纳米二氧化硅药物纳米化技术可提高药物的稳定性并提高药物的溶出速率。此外，多孔网状结构上分布的硅烷醇基使其易于进行化学改性或聚合物涂层，因此功能改性后的二氧化硅具有良好的性能可应用于新型生物材料应用方面。一般来说，二氧化硅的表面改性既可以用化学方法也可以使用物理方法。改性剂和二氧化硅纳米粒子间的化学相互作用非常强烈，而基于物理相互作用的表面修饰常借助于改性剂的活性基团与硅胶的硅烷醇基间的氢键作用或其他作用力。在许多硅胶表面修饰改性的方法中，聚合物涂层是一种可以扩展硅胶粒子性能的方法。生物相容材料作为很有前景的材料在生物医学应用方面引起了很多关注，例如药物或大分子的缓释、PH感应药物释放和组织靶向给药。但是，将二氧化硅的药物分散效应与聚合物的阻滞作用相结合以控制水难溶性药物的释放速度的报道几乎没有。我们将在此首次介绍将壳聚糖接枝二氧化硅（CTS-SNM）用作一种有效的药物载体，并对利用多孔二氧化硅的分散效应、壳聚糖溶胀性来控制药物释放速率以实现水难溶性药物的口服缓释传递进行可行性分析。为了实现这一目标，我们合成了一种球形纳米二氧化硅基质（SNM），接着通过后续的合成向二氧化硅的表面引入了壳聚糖链。利用溶剂蒸发法分别用SNM、CTS-SNM包载卡维地洛这一典型的BCSII药物。采用SEM、TEM、氮吸收、XRD、低温DSC、TGA和紫外分析对药物载体和载药复合物的理化性质进行系统的测定。研究壳聚糖接枝二氧化硅在模拟胃肠液中的结构变化及壳聚糖的溶胀性与药物体外释放性能间的关系。对标准大鼠进行体内测试进行药物的生物利用度及药代动力学研究。我们相信此次研究中制备的SNM和CTS-SNM会使聚合物及无机材料在制药领域有更广泛的应用，而我们所提供的最新的信息会有助于推动水难溶性药物缓释、速释口服药物传递系统的设计。实验部分实验材料：正硅酸乙酯（TEOS，优级纯）、1,3,5,-三乙基苯（TMB，分析纯）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，纯度99.0%）、乙醚（99.5%）产自Aladdin公司（中国，上海）。无水乙醇（99.5%）、二氯甲烷（99.5%）、醋酸（99.5%）产自山东禹王制剂公司。壳聚糖（脱乙酰度DAC≥95%）产自Haidebei生物技术公司（中国，上海）。商业卡维地洛胶囊产自西南合成制药股份公司。卡维地洛原药（纯度99.0%）由沈阳福宁药物公司（中国，沈阳）提供。所有化学制剂使用前均未经过任何提纯加工，实验用水采用去离子水，其他化学制剂都为市场上可买到的。球形纳米二氧化硅基质的合成：对已报道的合成过程进行修改合成SNM。典型的合成过程是向200ml反应器中加入500mgCTAB、70ml去离子水、60ml乙醇的混合液。待溶液澄清后，向表面活性剂溶液中加0.6mlTMB（四甲基联苯胺）。将混悬液500rpm磁力搅拌30分钟后，将1ml的氨水和20ml乙醚逐滴加至溶液中形成均一乳液。室温下强烈搅拌30min后，向混合物迅速加入5ml的TEOS，600rpm下搅拌4小时。用ATSAH100D匀质机在压力800bar下转20周期将所得到的白色沉淀均质化以减少纳米粒子的聚合。将所得产品过滤、充分洗涤，在60℃下干燥6h。最后，在一个大气压、600℃下焙烧6小时除去产物中的有机成分。壳聚糖包封制备CTS-SNM：将0.1g壳聚糖溶于100ml体积比为1.5%的乙酸溶液中得到壳聚糖溶液。600rpm下搅拌4小时使壳聚糖完全溶解。配制浓度为1w/v%的SNM溶液备用。包封过程中，在搅拌条件下用细针管将5ml0.1w/v%的壳聚糖溶液缓慢地逐滴加至同等体积1w/v%的SNM溶液中。将所得混合物静置4小时，使壳聚糖和二氧化硅间的作用更加完全，将所得混合物在6000rpm下进行离心分离，去离子水洗涤沉淀，反复五次。离心完成后，含有被壳聚糖包封SNM的沉淀在60℃下干燥一晚。将所得样品碾碎，过80目筛得到白色样品粉末。向SNM和CTS-SNM内注射药物：之所以选择卡维地洛这种种典型的BCSII类药物，就是因为它具有高渗透性、低水溶性的性质。药物的注入过程如图.1所示，首先在一密封小瓶内将60mgCAR完全溶解于二氯甲烷中(30mg/mL),以药物/硅质量比为1:2.5向溶液中加入150mg制备好的多孔二氧化硅。超声分散几分钟后室温下轻微震荡12h使药物载药量达到最大。最后，45℃蒸发24小时，完全脱溶剂。载药硅复合物即CAR-SNM过80目筛，贮存于真空干燥箱内。CAR-CTS-SNM的制备过程与CAR-SNM相似。FE-SEM和TEM研究：用场发射式扫描电子显微镜（JEOL-6700，日本）对SNM、CTS-SNM的形态及粒径进行表征。表征之前，首先应在真空下对样品进行喷金。用TecnaiG2F30TEM检测样品的多孔结构，测试前超声将样品溶于去离子水然后覆于碳膜覆盖的铜载网上。氮吸附分析：使用SA3100表面分析仪(Beckmancoulter,美国)对样品进行氮吸附等温线测试可得要样品表面及孔结构信息。测试前，SNM120℃真空脱气12小时，CTS-SNM和载药样品40℃真空脱气12h。测试点在相对压力P/P0为0.05-0.25时，用BET法测样品表面。用BJH法通过氮气的等温吸附线测定介孔的孔径分布。通过相对压力0.9814下的氮吸附量可计算全部孔体积。药物含量的UV、TGA分析：CAR-SNM和CAR-CTS-SNM的真实载药量是通过240nm紫外分析测定CAR载药复合物中甲醇浸取液中的真实含药量。该标准曲线的线性浓度范围为2.0—8.0mg/ml。以上测试均平行进行三次。同时我们也使用了TGA-50测定有效载药量。将3mg的样品在20ml/min的氮气吹扫下以10°C/min的加热速度由50℃加热至600℃。载药量和包封率分别按照紫外检测所得CAR量与CAR载药复合物、初始CAR总量之比计算。PXDR、DSC对样品固态表征：粉末X-射线衍射（PXRD）是确定载药样品及纯药晶体结构及变化最常用的方法。差示扫描量热法和低温差示扫描量热法作为样品表征的补充手段。实验仪器分别采用RigakuGeigerflex的PXRD、差示扫描量热仪(DSC60,ShimadzuCo.,日本)、低温差示扫描量热仪(Mettler-Toledo,瑞士)。接触角由5°逐步增加0.02°增至40°，扫描速率为4°/min测定样品的XRD谱图。用铟和锌标定差示扫描量热仪，在40ml/min氮气吹扫下，在铝盘内以10°C/min加热。在氮气30mL/min.吹扫下，以10°C/min速度从0℃加热至200℃进行低温DSC测定。平衡浓度研究:向20mL的去离子水、PH1.2磷酸缓冲液、PH6.8磷酸缓冲液加入过量的原药CAR、CAR-SNM、自制无定型CAR（一式三份）以确定不同CAR样品的平衡浓度。混合液置于37℃摇床内，在规定时间间隔内，取4ml上层液体经0.22μm的膜器过滤。波长240nm下紫外测定药物浓度。药物体外释放研究：用溶解装置（RC-8D，天津国明医疗设备公司）USPII桨法测原料药及载药复合物的溶出曲线。所有溶出度研究都在漏槽条件下平行做三次。相当于10mgCAR的CAR-SNM样品溶于两种不同的溶解介质（900ml）：无酶模拟胃液（SGF，pH1.2）和无酶模拟肠液（SIF，pH6.8）。溶出度测试进行90min。为了模拟药物在体内的释放，把相当于10mgCAR的CAR-CTS-SNM置于三种不同的释放介质中（900ml）：无酶模拟胃液（SGF，pH1.2）、无酶模拟肠液（SIF，pH6.8）、无酶磷酸缓冲液中24小时。保持桨速100±1rpm恒定温度（37℃）下进行药物的溶出释放测定。在适宜采样时间，取5ml溶出液经过0.22um膜器过滤，并立即补充5ml新鲜溶解介质以保持溶解介质量恒定不变。根据2010版中国药典规定，用紫外分光光度仪（UV-2000，Unico，USA）检测上述实验中卡维地洛的释放量。体外pH响应研究：为了能够全面评价体内药物从CTS-SNM释放的过程，我们用渗析袋法模拟CAR在胃肠道内的释放。具体实验步骤如下：首先，把装有30mgCAR-CTS-SNM的渗析袋放于盛有900mlpH1.2的PBS的大烧杯内，保持体系在温度37℃、搅拌转速150rpm条件下三小时。其次，将处理后样品按顺序置于900mlpH为4.5、6.8、7.4PBS缓冲液中1h、3h、6h以研究CAR在十二指肠、小肠、结肠内的释放行为。第二步中的实验条件除搅拌转速变为50rpm外，其余都一样。在特定时间间隔，取5ml溶出液按照上述体外药物释放所描述步骤进行后续的分析测定。壳聚糖接枝二氧化硅的溶胀性能：用SA3100表面分析仪测定特定表面及空隙体积，以描述胃肠道内CTS-SNM中壳聚糖结构的变化。简而言之，准备四个透析袋，向每个透析袋中加入一定量空白CTS-S