DNA测序常见问题解析

DNA测序常见问题解析一．引物问题Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？A：这里分以下几种情况：1.PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，而且刚刚开始的碱基由于在毛细管电泳中不能很好地分离而导致准确性下降，所以找不到您的引物序列。（1）对于较短的PCR产物（600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。（2）对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。（3）由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。2.有时质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外源片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。3.找不到克隆片段的扩增引物。发生这种情况原因有2个：（1）您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。比如pBluescriptⅡKS这个质粒如果采用SacI做工具酶，采用T7引物测序：那么从T7引物末端到SacI的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。解决的办法是采用M13Forward引物来测序，这样可以保证SacI的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。（2）您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的反向互补序列。或者您插入的片段可能不是您的目的片段，而是由于非特异性扩增出来的片段，还有可能您送过来的样品被污染。Q：测序发现引物有突变或缺失是什么原因？A：测序发现引物区有突变，主要考虑三个方面的原因：测序，PCR/克隆过程，引物本身。1.测序引入的错误对于PCR产物进行的克隆而言，无论是TA克隆或酶切克隆，引物区往往位于载体两端，如果用载体引物进行测序，此时克隆引物区离测序引物区的距离比较近，处于测序起始阶段或正好处于测序染料峰所在的区域内（90-120bp），这两个区域也是最容易产生测序错误的地方。因此，首先要看原始的测序峰图在引物区内是否清晰，碱基的错误或缺失是否是由于峰图不清楚而导致的计算机误读。2.PCR/克隆过程尽管使用高保真聚合酶进行PCR出错的可能性比较少，但不排除PCR错配或者克隆过程中突变的可能。有的人会问，PCR的突变怎么会出现在引物区呢？这是因为引物是单链，PCR产物引物区的互补链同样是以引物为模板进行扩增得到的，因此，有可能存在引物正确但其产物出错的情况。针对这种情况的解决方法是：进行测序时请送2-3个独立的克隆子进行测序，这样可以排除PCR过程出错或克隆产生突变的情况。3.引物本身错误如前面所述，引物合成是一种多步骤的化学反应，即使每一步合成效率达到99%，仍有1%的序列不能连接或错误地连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；对于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Capping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶联时将不能继续参与合成。对于实验中测序发现的较常见碱基缺失的可能原因如下：（1）由于DNA合成是沿着3'→5'端方向将碱基逐个连接上去的，每连上一个碱基，都需要经过(Detritylation,Coupling,Capping,Oxidation)一个循环。Coupling是上一个碱基的5'-OH与下一个碱基的3'活性部分发生反应，该反应的效率最高可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；（2）Capping是将没有连接上下一个碱基的5'-OH乙酰化，Capping的效率不可能达到100%，没有被乙酰化的5'-OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；（3）Detritylation是脱掉上一个碱基5'-OH上的保护基，准备连接下一个新碱基，Detritylation的效率也不可能达到100%，没有脱保护的5'-OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列；对于插入突变，引物序列中往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分碱基发生丢失DMT，处于活性状态的新碱基在没有与上一个碱基反应前发生自连，将会造成碱基重复，故会发生插入同一碱基的突变的失败序列。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体2,6-diaminopurine（脱嘌呤），DNA复制和PCR过程中DNA聚合酶将2,6-diaminopurine看作碱基A，发生G到A的转换，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。引物合成过程中，造成碱基缺失、插入、置换突变的因素客观存在，上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。但是基于目前大规模生产的纯化方法，还不能达到100%的纯度，对40mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是ULTRA-PAGE；而对40mer以上的DNA制品ULTRAPAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择ULTRAPAGE纯化或HPLC纯化的引物。测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率不大，但是偶尔也会发生。Q：如何选择（设计）测序用引物?A：引物的选择建议您尽量选用载体上的通用引物。若载体上有几对引物结合位点，请根据您插入目的片段位点选择（引物3'端离您所测的目的片段50-100bp左右较适宜）合适的引物，同时区别引物的方向。若没有合适的通用引物则需要按照以下测序引物的要求设计合成测序引物：1.引物长度20个碱基左右，3'端尽量选择G或C(不绝对)，以增加与模板的结合能力。2.Tm温度应选择50-60℃左右，GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。3.避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。4.保证引物和模板100%匹配，尤其是3'端的几个碱基一定要100%，必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。Q：PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?A：众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了，故PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。二．重复测序中样品问题Q：验证实验不能用我新送来的样品进行吗？A：抱歉，不能。我们会与您核对您原始样品的外观。如果我们已经将样品送还，那么在结果确认前请保留我们的标记，以便一旦需要验证可以重新提供。Q：我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？A：我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那么实验原则和验证实验是相同的。三．测序结果序列问题Q：你们给我的序列怎么在一串A/G/C/T后就没有信号了？A：重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。我们目前的原则是对于质粒DNA（闭合双链）上当存在30个以上的polyT/A时无论之后的信号质量如何，我们都会将报告发出，在PCR模板上这个限制的长度为15个碱基。相对A/T，G/C的影响更大一些，无论在何种模板上只要出现连续10个G或C，不管之后的信号质量如何，我们都会将报告发出。由于这样的重复序列对测序结果的影响是绝对的，所以还请测序客户在选择引物时尽量避开有重复序列的一端。Q：你们给我的结果上怎么有这么多的错误？明明这里有一个A/G/C/T为什么没有读出来？A：通常情况下测序报告的前端30个碱基由于会受到荧光染料的干扰，可能会存在错误，为保证您能够得到完整的目的序列，请您在选择测序引物时务必谨慎；序列的可靠程度视图谱峰形的质量而定，我们通常提供650-700个有效碱基；自动测序仪解读序列的准确性并非100%，虽经过我们技术人员的检查，还是有可能会有错读和漏读的情况发生，要达到100%的准确性只有进行不同方向的多次测序。Q：我的彩图和文件都丢了，能不能再给我提供一份？A：当然可以，不过出于保密原则我们的测序结果只保留6个月，而测序样品只保留1个月，所以您要追加实验或索取结果都需要抓紧时间Q：我要求5'到3'正向测序，为什么你们给我的序列是反的？A：您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3'引物和5'引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13F，M13R这样的形式来填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRI到HindIII”。我们手中的质粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。Q：我的样品已经测通了，但为什么在重叠区有这么多的错配，给出的全序列和单个报告也有差异，我该相信哪个？A：给出的全序列是一个拼接的结果，当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更好的为主，这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。通常在重叠去的位置总有一段序列是位于650bp可靠范围内的，我们在拼接全序列时也会以650bp之内的信号为准。有时候也会有特殊的情况，在这种情况下，需要通过人工判读峰图文件来选择正确的碱基，如果还不行，则需要加测反应进行确定。Q：我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？A：在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上给出的信号往往是比较强的一个信号。所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的，请在测序订单上注明，我们在修改报告时会加以注意。但如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出现这样的情况有可能是您样品本身杂合位点严重不对称，信号弱的一个被仪器当作基线处理，而尽量的压低。这也是测序方法检测杂合、突变不可靠的主要原因。Q：你们总提到由于出现重叠峰而取消测序，什么是重叠?A：下面的图谱就是一个典型的重叠的结果。从图中可以看到从第200位碱基以后在同一个碱基的位置上出现两个不同的峰形，导致这种结果的原因是：1.样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。2.样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模板中有其他DNA的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况。3.样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现重叠的情况。Q：为什么在测序的结果中，前