氨基酸的薄层层析实验报告

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握薄层层析法的一般原理。2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。二、实验原理1、薄层层析原理：将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不同，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不同，因此，不同的氨基酸样品在固定相上的移动速度也不同，可以彼此分离，以此分离鉴别不同氨基酸。2、氨基酸显色反应原理：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。三、材料与方法：以流程图示意Rf值=原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离1、材料：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细管、层析缸、药匙、烘箱、氨基酸标准溶液（0.01mol/L丙氨酸、0.01mol/L精氨酸、0.01mol/L甘氨酸）、混合氨基酸溶液、0.5%的羧甲基纤维素钠、硅胶、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）2、方法：制板点样层析显色数据处理步骤具体内容制板取0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，加入硅胶3g，搅匀成糊状后倒于洁净的玻璃板上均匀涂平，水平放置待其自然晾干，进行活化。点样用铅笔距底边2cm处均匀确定4个点并做好标记，用毛细管分别吸取适量丙氨酸、精氨酸、甘氨酸以及混合氨基酸溶液依次分别点于4个点上。层析将层析板放入装有展开-显色剂的层析缸内，静置1h。显色将层析板加热，即可显色。数据处理用刻度尺量得各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及展层剂前沿至样品原点中心距离，算出各斑点Rf值。表格1氨基酸的薄层层析实验步骤四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。1、结果：①实验数据：试剂用量硅胶3g0.5%羧甲基纤维素钠8ml表格2制作层析板的试剂及用量各色斑各氨基酸色斑中心至原点中心距离（cm）原点中心至展层剂前沿距离（cm）丙氨酸2.205.50表格3各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及展层剂前沿至样品原点中心距离记录各色斑Rf值丙氨酸0.40精氨酸0.20甘氨酸0.31混合点10.24混合点20.38混合点30.44表格4结果记录②现象：精氨酸1.10甘氨酸1.70混合点11.30混合点22.10混合点32.40图一制板图二层析图三显色（从左到右分别为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸）步骤现象制板将糊状混合物涂平于玻璃板上并静置后可得图一，图一晾干并活化后可得层析板。点样刚点样时能看到原点扩散边缘。干燥后，原点扩散边缘消失。层析展层剂沿层析板上行，1h后，展层剂前沿到达层析板1/2处，层析板上未见样品上行痕迹。显色加热后，如图三所示，层析板上显示出6个紫色色斑。其中，混合氨基酸样品分离出三个色斑。表格5实验现象2、讨论：①由表格4可知，混合点1Rf值与精氨酸相近，混合点2Rf值与甘氨酸相近，混合点3Rf值与丙氨酸相近。当展层剂相同，层析时间相同时，同一氨基酸的Rf值为定值，以此鉴别不同氨基酸。因此，在一定的实验误差要求范围内，混合氨基酸样品中含有丙氨酸，精氨酸，甘氨酸。②展层剂前沿不是一条水平的直线，可能是因为层析板上的硅胶分布不均匀，这会直接影响实验结果，导致较大实验误差。③将层析板从层析缸中取出后，应立即描出展层剂前沿界线，以免展层液挥发后界线下移，样品原点中心至展层剂前沿距离变小，导致实验误差。④展层剂不得超过点样线，否则样品溶入展层剂中，无法随展层剂上行，导致实验失败。⑤将层析板放入层析缸后，应及时盖上层析缸盖，以免展层剂挥发。⑥应在层析缸盖上涂抹凡士林，防止层析液挥发。⑦点样时，样品量要适中，加样原点扩散直径不得超过2mm。样品量太少，易导致斑点颜色太浅，有的成分不易显示，难以分析。样品量太多或加样时原点扩散直径太大，易造成斑点过大，斑点拖尾或互相交叉。