核酸扩增检测实验室设计及工作流程

核酸扩增检测实验室设计及工作流程卫生部临床检验中心问题？核酸检测实验室到底要分多少个区？缓冲间有何作用？使用什么样的生物安全柜？“无基因”或“无核酸”概念？核酸检测实验室最有效的“防污染措施”是什么？血液标本的接收通常的工作流程：标本采集血清分离编号保存或检测应在四个测定区域之外的地方或区域内接收接收的标本应收集在原始容器中在核酸提取时带入至标本制备区标本的接收区的仪器设备要求如果在标本接收区分离血清（浆）标本，有1台分离血清（浆）用离心机、1台生物安全柜、1台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。如果不在标本接收区分离血清（浆）标本，只是简单的接收，则就不需要分离血清（浆）用离心机、生物安全柜、加样器及其消耗品。理想的核酸扩增实验室设计A产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的核酸扩增实验室设计B核酸扩增检测实验室设计的一般原则各区独立注意风向因地制宜方便工作“十六字口诀”(1)在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态;(2)不能有空气的直接相通。由清洁区域向污染区域流动门试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区外走廊门门门门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区外走廊门门门门AB试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门门空气流向空气流向空气流向走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向空气流向其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门空气流向空气流向+空气流向++走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向+空气流向++其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室空气流向产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗核酸检测实验室设计产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。关于“区域”合并如使用扩增和产物分析同时完成的实时荧光PCR仪进行核酸扩增检测，扩增区和产物分析区可以合并。如使用核酸提取、扩增及产物分析等均在一台仪器上完成的全自动核酸检测分析仪，标本制备区、扩增区和产物分析区可合并。“无基因”或“无核酸”概念的重要性！！！尊敬的李教授：您好！来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！刘X20130508刘大夫：PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。此外，在实验室出现严重污染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。20130508李教授：您好！我是上次向您请教PCR实验室污染如何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现在实验室污染已经完全清除，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！2013.7.18尊敬的李教授：您好！您所说的措施我都实行过，只不过除通风外，其余措施仅实施过很少几次，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施要在三个区都进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响？谢谢您拨冗指教！刘X20130508好吃懒做原来是病毒在作怪2011年五大科学丑闻事件TheScientist符合基本要求的核酸扩增检测实验室的条件（1）试剂准备区、标本制备区和扩增及产物分析区等三个或四个区域在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。（2）各区的可移动的仪器设备及各种物品包括实验记录本、记号笔、试管架及清洁用具等必须专用。（3）应在标本制备区、扩增及产物分析区等相对有可能出现“污染物”的区域安装排风扇或其它排风和有效的装置，以使空气按试剂准备区标本制备区扩增（及产物分析）区方向流动。核酸扩增实验室的工作流程试剂准备区标本制备区扩增区及扩增产物分析区试剂贮存准备区核酸扩增实验室中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在，包括试剂中所带的标准品和阳性对照。所有实验用洁净物品如离心管、吸头等的存放和准备处。商品试剂盒：75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水、有机溶剂等可能需要自配自制试剂：一次较大量配制，然后分装成小瓶保存，每次检测时，取出一小瓶使用，未用完的即弃掉，不再使用。仪器设备主要有加样器、天平、离心机和冰箱等，最好配备超净工作台。标本制备区仪器设备主要有混样设备、核酸提取仪、生物安全柜、加样器、高速台式（冷冻）离心机、加热模块或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不应放在实验室门口等易受人员走动影响的地方，也不应直对分体式空调。主要是用于血液样本的混样、核酸样本的提取。加样器吸头必须带滤芯。使用加热模块时，如在模块孔中填入二氧化硅细砂，然后将标本管置于细砂中温育，可得到较为一致的温育温度。扩增及产物分析区扩增反应体系的配制和提取核酸的加入，可在标本制备区也可在本区内进行，关键是要防止产物的污染。如果空间允许的话，也可在一个独立的区域内进行。加样时，先加提取的核酸模板样本，每加完一个即盖好盖子，然后加阳性质控核酸模板，再就是标本制备阴性质控和仅含按样本一样稀释的主反应混合液的扩增阴性质控，这样做的目的是，最大可能地测出以前扩增产物的交叉污染。扩增及产物分析区热循环仪的电源应专用，并配备一个不间断电源（UPS）或稳压电源。每次扩增后，可使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射。扩增仪应定期进行校准。核酸扩增实验室最有效的防“污染”措施实验室的“通风”次氯酸钠溶液的使用1mol/LHCl溶液的使用紫外照射75％或无水乙醇溶液空中喷雾Thanks!