DNA计算中荧光技术的应用及其发展

《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）DNA计算中荧光技术的应用及其发展张成杨静王淑栋(北京大学信息科学技术学院，高可信度软件技术教育部重点实验室，北京100871)摘要：DNA计算作为前沿科学研究的重点和热点，已经从简单发展为复杂，从理论转化为应用。在这一过程中，反应速度快，变化灵敏的荧光标记技术发挥了重要的作用。本文围绕DNA计算和荧光标记技术两个方面进行说明。一方面，对近年来DNA计算中荧光技术的应用进行了总结：（1）荧光标记的表面计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术。另一方面，介绍了几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才能发挥DNA计算天然的优势。关键词：DNA计算；荧光标记技术；纳米技术；DNA分子；杂交1引言DNA由于其具有的特性，在大自然的进化中，被选择为稳定的遗传物质。在细胞中，DNA精细地编码并控制着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易构成二级甚至三级结构。因此，DNA作为计算工具有着得天独厚的优势1,2。近年来，DNA计算领域发展迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而伴随着DNA计算解决问题的规模增大和形式多样化，求解过程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构复杂性的加大，求解过程中实验过程繁琐且存在误差，使得DNA计算中解的标记和检测变得更加困难4。为了解决这一难题，荧光技术在DNA计算中逐渐得到了广泛的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光激发后，其原子中的电子被激发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的π-π共轭体系。在激发态时，这种结构具有稳定性，可以持续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技术在生物学领域中已经有很多应用，如近年来发展起来的DNA荧光标记、real-time检测技术、分子信标技术等。荧光标记DNA简单便捷，可以实时检测，而且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA计算中具有广泛的应用前景。目前，结合荧光技术的DNA计算已经成为前沿研究热点。荧光技术在DNA计算中的应用主要有如下几类：（1）荧光标记的表面计算：通过DNA固定化和杂交技术，在固相表面通过荧光标记进行计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测：利用特定酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术：巧妙利用DNA分子的三链甚至多链结构，通过加入引发链，来释放另一DNA链。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门：利用RNAi技术控制表达荧光蛋白，从而构建了多重逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术：在DNA自组装结构的基础上，结合了荧光标记技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术：通过DNA分子的不同状态，构建了可控的荧光纳米装置。近年来，荧光技术不仅应用于生物学本身，而且在DNA计算、信息学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面有几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。相信随着DNA计算和荧光技术的发展，这两者必将紧密《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）结合，使得DNA计算的种类和方法更加多样和成熟。2DNA计算中荧光技术的应用2.1荧光标记的表面计算DNA表面计算其基本原理是：通过DNA固定化和杂交技术，将代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通过多次的杂交以及降解过程来筛选正解。通过荧光标记可以检测每次和最终计算的结果。2002年，Adleman组使用杂交池完成了一个20个变量的3可满足性问题6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基础上，设计了一种通用型的DNA表面计算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用单分子杂交荧光标记技术4个变量的可满足性问题9。下面以2000年，Liu等发表在nature上的DNA表面计算经典实验为例，说明其解决SAT问题的过程7。由于该问题共有16种可能性，故将代表着不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的杂交筛选过程中，加入与固定DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的固定DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶Ⅰ降解。通过数次操作，存在于固相表面的DNA链就是每次经杂交而保留下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技术主要应用在解检测的过程中：使用一条生物素标记的引物和另一条荧光标记的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分离双链，分离出荧光标记的ssDNA。将这些ssDNA与经过多次杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相表面的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。图1-1实验示意图图1-2列阵荧光检测结果2.2与某些酶切技术相结合的荧光检测利用酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。其实就是利用某些酶与DNA分子空间结构的相互作用，再结合荧光技术来共同实现的。这种方法具有灵敏度高，反应速度快等特点。其最大的优点就是巧妙地将酶的生物特性与计算问题相结合，极大地丰富了DNA计算的手段。2001年，Wang等在上述表面计算实验的基础上对解的检测又进行了新的改进，即将酶切和荧光技术相结合10。通过上述核酸外切酶的方法，利用新技术完成单链DNA的解的检测。其基本思想如下：左侧DNA探针的3’端至少和右侧杂交的DNA探针有一个碱基的重合，并使得右侧探针有5’端呈单链状态。此时右侧探针由两部分组成：一部分是和目标序列形成双链的；另一部分则是由非互补的5’端DNA链组成（见图2A）。此时该非互补的5’端DNA臂会覆盖在上游寡核苷酸链上，与左侧探针至少有一个重合的碱基。恰恰在这重合的位置，可以形成酶切位点。因此，非互补的5’端DNA臂可以被切割而释放。利用这一原理，结合荧光技术，如图所示，将荧光基标记在非互补DNA链的5’端，而将荧光淬灭基标记在重合的酶切位点3’端方向（见图2B）。这样，只要酶切位点被酶切，标记有荧光基的非互补的5’端DNA链就会被释放，从而与荧光淬灭基分离，使得荧光释放量《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）大大提高。这种方法可以有效检测目的片断是否存在。文中还将PCR方法检测目的片断与这种荧光检测法进行了对比，发现该方法比PCR检测具有更高的灵敏度。图2实验原理示意图图3几种逻辑门的构成示意图MilanN.等2003年研制了一种名为MAYA的游戏。这是一种利用特殊的DNA酶E6（一种依赖于DNA的RNA酶）构建起来的逻辑门11。这种酶识别的DNA底物要求具有特殊结构（如3a图所示）。只有当上部寡核苷酸探针与E6的支架区互补，上部寡核苷酸才能被切断释放。将寡核苷酸两端分别标记荧光淬灭基（如罗丹明）和荧光基，那末只有寡核苷酸探针被切断释放，荧光基才能有效激活并释放荧光。这是MAYA游戏进行逻辑判断的主要检测手段。构建有效的空间位阻是实现这个检测手段的关键。当寡核苷酸探针的结合使绿色标记的位阻消失的时候，加速酶切反应；当寡核苷酸探针的结合使红色标记的位阻消失的时候，降低酶切反应。基于以上原理，构建出以下几种逻辑门：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型逻辑门（图3b所示），当i1寡核苷酸加入时，消除原来i1环状结构，从而标记的荧光探针可以与之结合，并且被切除释放。其判断过称为加入i1，荧光输出。NOT型逻辑门（图c所示）。当加入i6时，环状结构打开，荧光结合的寡核苷酸探针无法结合在互补区域，于是无荧光输出。其判断过程为加入i6，荧光输出停止。AND型逻辑门（图d所示）实际上是将两个YES型逻辑门组装在一起。也就是说，只有当i1和i6都被加入时，才能有荧光输出。AND-AND-NOT型逻辑门（图e）是更为复杂的组合体。必须同时加入i1和i3，才能输出荧光。然而，只要有i6存在，就不会输出荧光。文中解决的问题是在3×3的棋盘中完成3个棋子同线相连。考察所有的逻辑情况后，将所有可能的逻辑门都提前置于棋盘的网格中。再将代表棋子的寡核苷酸分别放入，然后观察荧光输出情况进行判断。2.3与DNA链置换相结合的荧光技术该技术多用来构建DNA逻辑门。其巧妙利用DNA分子的粘贴，通过加入引发链，来释放另一DNA链。在逻辑计算中，这种技术具有循环性、自引发性、反馈性、灵敏性和准确性等特点。近年来在science等高水平科研杂志上都发表了大量系列工作，而且在生物检测领域具有广泛的实际应用前景。2000年，BernardYurke构建了一种DNA链置换机器，在置换过程中可以实现闭合式运动12。2003年，B.Yurke等构建了一种基于DNA链置换的纳米机器《计算机学报》2009年12期，2009，32（12）13。Jong-ShikShin等利用可反复的DNA链置换，构建了可以反复读取和输入的三状态存储器14。2006年，GeorgSeelig等对DNA链相互粘贴、置换的几种模式进行了实验15。2006年，SimonJ.Green等用茎环结构实现了DNA链的粘贴互换16。2007年，DavidYuZhang等实现了DNA链置换的循环进行17。2007年,suvirvenkataraman等实现了通过DNA链自粘贴来完成多段DNA聚合延伸18。下面介绍两个具有代表性的工作。2006年，Georgseelig等报道了一种没有酶参与的DNA逻辑门19。其基本原理如图4-1所示，即先构建好由寡核苷酸链G、Eout、F共同杂交组成的DNA互补结构，再加入Gin寡核苷酸链。此时，由于Gin一侧末端和G的一侧单链末端互补，从而使逻辑门中的G寡核苷酸链被释放，与Gin形成互补双链。此时的互补结构中，只剩下了寡核苷酸链Eout和F。然后再加入Fin寡核苷酸链，Fin的一侧末端与F中间有互补序列，加之Eout本身形成的是单链环状的不稳定结构，于是，F和Fin结合成双链。Eout寡核苷酸链被释放。文中使用了荧光标记地对Eout的释放情况进行了检测（如图4-2所示）。Eq末端标记有荧光基，而Ff末端标记有荧光淬灭基。当其互补结构存在时，荧光恰被淬灭，从而无法检测。但是，当Eq和Ff分离时，荧光就被释放出来，从而表明DNA链的分离情况。上述由G、Eout、F的DNA互补结构就可以构成与门。也就是说，只有同时加入Gin和Fin，才能诱发释放出荧光。值得注意的是，文章并不只是提出这种DNA计算逻辑门，而是将其应用到生物基因检测的中。在鼠脑总RNA中，成功的检测了数个基因的表达情况。图4-1链置换原理示意图图4-2荧光标记原理示意图2008年，PengYin等对这种DNA自粘贴、链置换进行了更为精细的研究20。其主要原理是利用DNA茎环结构的链置换。如图5-1所示，茎环结构A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列构成的，在茎环结构末端有未互补的单链DNA区域。如果加入与末端单链DNA互补的序列，整个茎环结构就会打开（图中的at与at*可以互补，其它同理）。因此，当体系中只加入A、B这两种茎环结构时，相互之间无任何影响。但是，当体系中加入了寡核苷酸链I后，就触发了整个循环。I先和A末端互补，使得A的茎环结构打开。此时，A的Bt区域与B的Bt*相互作用，使得B的茎环打开。当B完全打开后，B的a*区域会与I竞争A的a区域形成互补结构。被置换掉的I就可以重新激发新的循环。在上述基础之上，PengYin等设计了多种复杂结构的实验：直线型、回路型、支架型、自动位移型（见图5-2