葡萄糖测定-葡萄糖氧化酶法

葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase，POD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。【试剂】1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于蒸馏水800ml中，用1mol/L氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调pH至7.0，用蒸馏水定容至1L。2．酶试剂称取过氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于磷酸盐缓冲液80ml中，用1mol/LNaOH调pH至7.0，用磷酸盐缓冲液定容至100ml，置4℃保存，可稳定3个月。3．酚溶液称取重蒸馏酚100mg溶于蒸馏水100ml中，用棕色瓶贮存。4．酶酚混合试剂酶试剂及酚溶液等量混合，4℃可以存放1个月。5．12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至lL。6．100mmol/L葡萄糖标准贮存液称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h以后方可使用。7．5mmol/L葡萄糖标准应用液吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。【操作步骤】1．自动分析法按仪器说明书的要求进行测定。2．手工操作法取试管3支，按下表操作。葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清－－0.02葡萄糖标准应用液－0.02－蒸馏水0.02－－酶酚混合试剂3.03.03.0混匀，置37℃水浴中，保温15min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。【计算】【参考范围】空腹血清葡萄糖为3.89～6.11mmol/L。【临床意义】1．生理性高血糖可见摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。2．病理性高血糖(1)糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。(2)内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。(3)颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。(4)脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3．生理性低血糖见于饥饿和剧烈运动。4．病理性低血糖(特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等)(1)胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等，使胰岛素分泌过多。(2)对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少。(3)严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。【注意事项】1．葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约36%为α型，64%为β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应。国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是α型，故须放置2h以上(最好过夜)，待变旋平衡后方可应用。2．葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。3．测定标本以草酸钾－氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾6g，氟化钠4g。加水溶解至100ml。吸取0.1ml到试管内，在80℃以下烤干使用，可使2～3ml血液在3～4天内不凝固并抑制糖分解。4．本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠。5．严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。【评价】线性范围至少可达22.24mmol/L，回收率94%～105%，批内CV为0.7%～2.0%。批间CV为2%左右，日间CV为2%～3%。葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较，73份标本葡萄糖氧化酶法均值为8.31mmol/L，已糖激酶法均值8.21mmol/L，相关系数为0.9986，回归方程y=1.0026x－2.29。本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达10g/L，黄疸标本胆红素浓度达342μmol/L，维生素C小于30mg/L，均不影响测定结果。氟化钠浓度达2g/L不干扰测定结果。标本中含尿素浓度达46.7mmol/L，尿酸浓度达2.95mmol/L，肌酐浓度达4.42mmol/L。半胱氨酸浓度达3.30mmol/L，甘油三酯浓度达5.6mmol/L，胆固醇4.40mmol/L，对测定结果均无显著影响。左旋多巴100mg/L，维生素C5mg/L以上，谷胱甘肽100mg/L时，可引起负误差；半胱氨酸达10mmol/L时，产生相当0.72mmol/L葡萄糖的正误差。