SDS-PAGE&电洗脱

SDS-PAGE法电洗脱纯化蛋白质一、目的：使存在于包含体中的目的蛋白得到分离纯化，使目的蛋白纯度达95%。二、原理：SDS-PAGE即变性凝胶电泳，是把十二烷基磺酸钠（SDS）引入到聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中而得来的。在SDS-PAGE中，SDS与蛋白质或多肽结合，经过热变性和二硫键的还原，形成了相对一致的带负电荷的分子，SDS与蛋白质或多肽的结合破坏了蛋白质的三级结构，形成了蛋白质分子的非折叠衍生物，SDS-PAGE具有凝胶过滤和一般电泳分离的双重效应，可灵敏地分离亚基分子量不同的蛋白质。SDS-PAGE的优点不仅在于其快速、经济和高度重复性，而且在于其高度准确性和高分辨能力。大多数蛋白质在SDS中是可溶的，即使最碱性的蛋白质也能转变为其酸性衍生物在电场中向阳极移动。注意：SDS对蛋白质的变形作用是不可逆的。凝胶浓度越高，电泳电压也要求较高，电泳时间也要求延长，这样在电泳过程中会产生较多的热量，过多的热量对蛋白不利，应此4℃环境中进行电泳。三、试剂与仪器：1、试剂：30%聚丙烯酰胺5MTris-cl(pH8.8)1.0MTris-cl(pH6.8)10%SDSTEMED过硫酸铵6×ProteinLoadingBuffer5×SDS-PAGE电解缓冲液Cucl2染色液Cucl2脱色液凡士林2、仪器及工具：稳压电泳仪（BIOMETRA）北京六一仪器厂DYY-III24A型双面立式电泳槽200型水平电泳槽（BIORAD）透析袋透析袋夹铁夹镊子小刀染色盒脱色盒玻璃板板条胶布普通滤纸洗瓶玻璃棒烧杯四、操作步骤：1、洗板：先用洗衣粉把配胶用的玻璃板洗干净，再用去离子水冲净，略倾斜放置于吸水纸上并用试剂瓶作依托晾干。2、配胶：1）架板：将晾干的玻璃和板条组装起来，两板条放于两玻璃间的两边，铁夹夹紧两边，使玻璃间形成一薄槽，以便注入凝胶。装毕，竖立于水平桌面上，使底部齐平并用胶纸封住，用指甲用力抠紧，以免漏胶。2）配胶：a.依据欲分离蛋白大小选择合适分离胶浓度配方（见附表）配制分离胶储液。b.每板胶由5ml封底快胶、60ml分离胶、15ml5%积压胶组成。c.快胶：吸5ml分离胶储液于烧杯中，加入80ulAps和15ulTEMED，迅速用移液管吸出沿两板条内侧加入玻璃板间，稍等片刻即凝。d.分离胶：往剩余60ml分离胶储液中加入600ulAps和24ulTEMED，混匀，倾斜玻璃板，慢慢倒入玻璃板中，并在其上层加入3ml无水乙醇，轻摇玻璃板，使胶均匀凝固，并可除去胶内部的气泡并有隔绝空气的作用，竖放约20min后即凝固，倒去上层的乙醇，用去离子水洗净残余乙醇，并用滤纸吸净胶面水分。e.积压胶：配制积压胶储液15ml，加入150ulAps和15ulTEMED，混匀，倒入玻璃板间，其上层加入用3ml无水乙醇封住，轻摇玻璃板，除去胶内气泡约15min后凝固，倒去胶面乙醇，用去离子水洗净，滤纸吸干。3）装板：在立式电泳槽两侧均匀涂上一层凡士林，撕去已凝固胶玻璃板底部的胶布，将有凹槽面玻璃板朝电泳槽，使与凡士林均匀接触以免电泳时泄露电解液，然后用铁夹夹住两边使玻板与立式电泳槽紧紧靠在一起。3、添加电解液：配制1×SDS-PAGE电解缓冲液，（一般由5×SDS-PAGE储液稀释而来），在每个电泳槽的上下槽注入电解液，约需加1200ml电解液。4、制样：洗净一小烧杯，把6×ProteinLoadingBuffer溶于样品蛋白中，吹匀，得1×蛋白上样样品。5、上样：用1000ul取样器吸取1×蛋白上样样品，沿玻璃板壁慢慢住入。上样量要根据蛋白样品中目的蛋白浓度高低而定。浓度高，上样体积小；相反则体积大。6、电泳：1）将电泳槽正负极与电泳仪正负极相连，注意别接反正负极。2）打开电源，先用80V电压跑积压胶，约2hr后升压至130V跑分离胶，约需12hr，溴酚蓝渐渐跑出，等溴酚蓝基本跑出胶后，即可断电，卸胶。注意电泳场所是4℃的层析柜。7、卸胶：倒去电泳槽中的电解液，取下玻璃板，推出板条，再撬开玻璃板，用板条切下胶的上部和下部，注意别把目的带也切掉，并在胶下沿切一个角，以作标记。8、染色：戴上手套，把切好的胶放入染色盒，先用去离子水洗一洗，倒去水，用事先配好的Cucl2染色液染色20~30sec，取出胶在黑色背景下切下目的带。若杂蛋白带与目的蛋白带靠太近时，为防止切错胶可适当延长染色时间，注意染色时间太长可能影响蛋白活性。9、切胶：先洗净一块玻璃板、脱色平皿和切胶专用刀，注意都应用去离子水洗净，并在脱色平皿中放入一定量的去离子水。将玻璃板放于黑色桌面上，并在玻璃上下各放点水，以利观察。把已染色胶放于玻璃板上，肉眼确定好目的带，用小刀沿着目的带边缘切下目的蛋白带，用刀挑入脱色平皿中。注意别把杂带也切下，而且要防止操作中污染目的蛋白。10、脱色：把脱色平皿放在摇床上，盖上盖子，先用去离子水脱色20min，倒干，再用电洗脱脱色液脱色，约20min换液一次，直到蛋白带略呈透明状为止。注意节约使用脱色液，脱色液只需淹过蛋白带即可，且尽量用小一点的平皿脱色。11、透析：洗净水平电泳槽，倒满1×电解缓冲液，用剪刀剪下一段透析袋，放入电解液中浸泡片刻，用透析袋夹先夹住一头，带上手套撮开透析袋，用干净的镊子夹断脱完色的蛋白带，放入透析袋中，加入一定量的电解液，用透析夹将透析袋另一头夹紧，放入电泳槽中浸泡15min以上，通电电泳洗脱，电压维持在100V，约50min后，调换电泳两极，反跑2min，停止电泳，取出透析袋，将袋中的目的蛋白液吸入一干净的管中，低温冻存。通常，每个蛋白样品可以透析四次。途中，若电流超过80mA，电解液开始变热，可以更换电解液解决。注意，此透析过程的环境温度是4℃左右，取透析袋时，一定要带上手套。12、清理：把操作过程中所用的一切容器洗干净，并把电泳槽用水冲干净，收拾桌面上的残遗物，保持实验室整洁，将所用工具仪器放回原位。四、附项：1、玻璃板规格：每板胶需两块普通玻璃板，规格为20cm×20cm，其中一块上部呈“凹”状，如下图所示2、试剂配制：1)30%聚丙烯酰胺配制：100ml的溶液中用去离子水溶解29.0g丙烯酰胺和1.0g双丙烯酰胺，可在37℃加热搅拌助溶，再用滤纸真空抽滤收集滤液使用。2）1.5M/LTris-cl的配制：1000ml的溶液中用去离子水溶解186.0gTris干粉3）1.0M/LTris-cl的配制：1000ml的溶液中用去离子水溶解124.0gTris干粉4）5×SDS-PAGE电解缓冲液储液的配制：1000ml的溶液中用去离子水溶解15.1gTris干粉94.0gGlycine干粉5.0gSDS干粉5）1×SDS-PAGE电解缓冲液的配制：由5×SDS-PAGE电解缓冲液储液稀释而来6）Cucl2染色液的配制：500ml的溶液中用去离子水溶解25.6gCuCl2干粉7）Cucl2脱色液的配制：1000ml的溶液中用去离子水溶解93.0gEDTA干粉31.0gTris干粉调pH=9.08）10%SDS的配制：100ml的溶液中用去离子水溶解10.0gSDS干粉9）6×Loadingbuffer的配制：100ml的溶液中溶解30ml1.0M/LTris-cl60ml甘油5.0mlβ-巯基乙醇注意要充分搅匀1.2g溴酚蓝24gSDS10）10%过硫酸铵的配制：100ml的溶液中溶解10.0g过硫酸铵干粉11）TEMED的保存：将新购瓶装TEMED瓶身包上一层铝箔避光保存于4℃冰箱3、常用不同浓度聚合胶的配制：（见下表）