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中和试验物受到病毒感染后,体内产生特异性中和抗体,并与相应的病毒粒子呈现特异性结合,因而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。中和试验(NeutralizationTest)是以测定病毒的感染力为基础,以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,来判定免疫血清中和病毒的能力。中和试验常用的有两种方法:一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合,另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合;然后把血清-病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后,接种于敏感细胞、鸡胚或动物,测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡,说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量,故中和试验可应用于:1.病毒株的种型鉴定:中和试验具有较高的特异性,利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清,即可测知相应血清或病毒的型,所以,中和试验不但可以定属而且可以定型。2.测定血清抗体效价:中和抗体出现于病毒感染的较早期,在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低,可显示动物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。毒素和抗毒素亦可进行中和试验,其方法与病毒中和试验基本相同。用组织细胞进行中和试验,有常量法和微量法两种,因微量法简便,结果易于判定,适于作大批量试验,所以近来得到了广泛的应用。(一)定血清-稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位:衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD),即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系,在越接近100%死亡时,对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时,对剂量的变化越敏感,故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位,即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时,毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。用细胞培养测定时,用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时,则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。(1)LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。测定方法:将接种病毒,并已发病濒死的小鼠,无菌法取脑组织,称重、加稀释液充分研磨,配制成10-1悬液,3000r/min离心20分钟,取上清液,以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3……10-9,每个稀释度分别接种5只小鼠,每只脑内注射0.03ml,逐日观察记录各组的死亡数。表2-24LD50的计算(接种剂量为0.03ml)病毒稀释度接种鼠数活鼠数死鼠数积累总计死亡比死亡率(%)活鼠死亡10-450501515/1510010-550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/10010-95501500/150LD50的计算:按Reed和Muench氏法计算。高于50%的死亡分数-50%83%-50%距离比例=────────────────────=──────=0.5高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数83%-17%LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数本例高于50%病毒稀释度的对数-6,距离比例为0.5,称释系数的对数为-1。代入上式:LgLD=-6+0.5×(-1)=-6.5则LD50=10-6.5,0.03ml,即该病毒作10-6.5稀释,接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。注意:稀释血清法中和试验,计算TCID50或LD50,MID50时,计算公式应改为:TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数。如按Karber氏法计算,其公式为:IgLD50(或TCID50)=L+d(S-0.5)L为病毒最低稀释度的对数,d为组距,即稀释系数,S为死亡比值的和。本例L=-4,d=-1,S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=-4+(-1)×(3-0.5)=-6.5则LD50=10-6.5,0.03ml注意:用本法计算稀释血清中和试验中和效价时,S应为保护比值之和。(2)EID50的测定(以新城疫病毒为例)将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度,分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔,鸡胚必须来自健康母鸡,并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml,每个稀释度接种6只鸡胚为一组,以石蜡封口,置37-38℃培养,每天照蛋,24h之内死亡的鸡胚弃掉,24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天,取尿囊液作血球凝集试验,出现血凝者判阳性,记录结果,按上述方法计算EID50。(3)TCID50的测定(以致细胞病变病毒为例)取新鲜病毒悬液,以10倍递次稀释成不同稀释度,每个稀释度分别接种经Hank’s液洗3次的组织细胞管,每管细胞接种0.2ml,每个稀释度接种4只细胞管,接种病毒后的细胞管放在细胞盘内,细胞层一侧在下,使病毒与细胞充分接触,放置37℃吸附1h,加入维持液,置37℃培养,逐日观察并记录细胞病毒管数,按上述方法计算TCID50。2.中和试验(1)病毒稀释度的选择选择病毒稀释度范围,要根据毒价测定的结果而定,如病毒的毒价为10-6,则试验组选用10-2-10-8对照组选用10-4-10-8其原则是:最高稀释度要求动物全存活(或无细胞病变),最低稀释度动物全死亡(或均出现细胞病变)。(2)血清处理用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清,灭活的温度和时间也是不同的。(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围,将病毒液作10倍递次稀释,使之成为所需要的稀释度。(4)感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内,第一排每管加入与病毒等量的免疫(或被检)血清作为试验组;第二排每管加入与免疫(或被检)血清同种的正常阴性血清作为对照组;充分摇匀后放37℃感作12h。(5)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物(或鸡胚、组织细胞)。观察持续时间,根据病毒和接种途径而定。(6)中和指数据计算物按Reed和Muench两氏法(或Karber)法分别计算试验组和对照组的LD50(或EID50、TCID50)试验级LD50(EID50、TCID50)中和指数=──────────────────对照组LD50(EID50、TCID50)假如试验组LD50为10-2.2,对照组LD50为10-5.6。则中和指数为103.3,103.3=1995,也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。(7)结果判定固定血清―稀释病毒法进行中和试验,当中和指数大于50,表示补检血清中有中和抗体;中和指数在10-50为可疑;若中和指数小于10为无中和抗体存在。(二)固定病毒-稀释血清法(血清中和试验)1.病毒毒价的测定(微量法)(1)病毒的制备将病毒接种于单层细胞,37℃吸附1h后加入维持液,置温箱培养;逐日观察,待细胞病变(CPE)达75%以上,收获病毒悬液冻融或超声波处理,以3000r/min离心10min,取上清液,定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用,选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。(2)病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶,将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1,10-2,10-11……,每孔病毒悬液量为50μl,每个稀释度作8孔,每孔加入100细胞悬液,每块板的最后一行设8孔细胞对照,制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养,从48-14h逐日观察细胞病变,记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID50。56%-50%距离比例=────────56%-33%本例高于50%病毒稀释度的对数为-6,距离比例为0.26,稀释系数的对数为-1。表2-25TCID50计算(接种剂量50μl)病毒稀释度接种数CPE数无CPE数累计CPE率百分数(%)CPE无CPE10-288039039/3910010-388031031/3110010-487123123/249610-585315415/197910-684410810/185610-78446126/183310-88262182/201010-98080260/260IgTCID50=-6+0.26×(-1)=-6.3则TCID50=10-6.3,50即病毒作10-6.3稀释,每孔接种50μl,可使半数组织细胞管发生病变。2.中和试验(1)血清的处理动物血清中,含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用,如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素,用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清,须采用不同温度处理,猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃;水牛、狗及地鼠血清为62℃;马兔血清为65℃;人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min,60℃以上加热时,为防止蛋白质凝固,应先以生理盐水作适当稀释。(2)稀释血清取已灭活处理的血清,在96孔微量细胞培养板上,用稀释液作一系列倍比稀释,使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64,每孔含量为50μl,每个稀释度作4孔。(3)病毒取-70℃冰箱保存的病毒液,按经测定的毒价作200TCID50稀释(与等量血清混合,其毒价为100TCID50)。如本例病毒价为10-6.3,50μl。所以应将病毒作2×10-4.3稀释。(4)感作每孔加入50μl病毒液,封好盖,置于37℃温箱中和1h。病毒与血清混合,0℃下,不发生中反应,4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h,一般病毒都可发生充分的中和反应。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作,根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。(5)加入细胞悬液在制备细胞悬液时,其浓度以在24h内长满单层为度:血清病毒中和1h后取出,每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO237℃温箱培养,自培养48h开始逐日观察记录,14h终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同,终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。(6)设立对照为保证试验结果的准确性,每次试验都必须设置下列对照,特别是在初次进行该种病毒的中和试验时,尤为重要。阳性和阴性血清对照:阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验,阳性血清对照应不出现细胞病变,而阴性血清对照应出现细胞病变。病毒回归试验:每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆,先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID50稀释,每个稀释度作4孔,每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。0.1TCIDTCID50应不引起细胞病变,而且100TCIDTCID50必须引起细胞病变,否则该试验不能成立。血清毒性对照相:为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用,设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清(相当于中和试验中被检血清的最低稀释度)。正常细胞对照相:即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征,为避免培养板本身引起试验误差,应在每块板上都设立这一对照。(7)结果判定和计算当病毒回归试验,阳性、阴性、正常细胞对照相,血清毒性对照全部成立时,才能进行判定,被检血清孔出现100%CPE判为阴性,50%以上细胞出现保护者为阳性;固定病毒稀释血清中和试验的结果计算,是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度,该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果,如表2-2680%-50%距离比例=──────=0.580%-20%IgTCID50=高于50%血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数IgTCID50=-1.5-0.5×(-0.3)=-1.35表2-26固定病毒-稀释血清
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