脂质体的制备

实验十五脂质体的制备1.了解脂质体（liposome）在细胞工程技术中的应用及其制备方法。2.掌握采用超声波法、冰冻干燥法和冻融法三种不同的方法制备脂质体的方法并了解该技术在细胞工程中的应用。一实验目的脂质体（liposome）的制备技术，一般采用超声波法、振荡法、乙醚蒸发法、去污剂透析法、冰冻干燥法和冻融法等。制备方法不同，所得脂质体结构、大小不同，性质和用途也就不同（表15-1）。二实验原理种类制备方法大小(m)特性多层大脂质体(MLV)乙醚蒸发法、醇醚水法、振荡法、液相快速混合振荡法0.1~50易制备，包被物释放速度慢单层小脂质体(SUV)直接超声波法、溶剂超声波法、乙醚注射法0.02~0.05体积小，适合包被离子、小分子药物等单层大脂质体(LUV)递相蒸发法、去污剂（胆酸纳等）透析法、冰冻干燥法0.05~0.5适合包被蛋白质、RNA、DNA片段、大分子药物及细胞融合单层巨大脂质体(GUV)冻融法5~30适合包被蛋白质、RNA、DNA片段，除菌处理较难本实验采用超声波法、冻融法、冰冻干燥法三种不同类型的方法，超声波法的原理是：在超声波作用下，磷脂类双亲媒性分子被打碎为分子或分子团，并自动重新排布成类似生物膜的双分子层囊泡。冻融法是在超声波法形成的小脂质体基础上，通过冷冻和融解过程使其破裂，重组为大体积脂质体，在通过透析时膜内外渗透压的变化而膨胀为更大体积的脂质体。冰冻干燥法语原理与冻融法基本一致，只在处理条件上有所不同。1.器材超声波清洗机、光学显微镜、荧光显微镜、荧光分光光度计、漩涡混合器、核酸蛋白检测仪、柱层析装置、冰冻干燥机。2.试剂１）磷脂液：100mg经丙酮-乙醚法纯化的卵磷脂，57.2mg胆固醇，溶于1ml氯仿。２）荧光液：钙黄绿素（calcein）47mg溶于100mlTris缓冲液。３）Tris缓冲液：称取Tris0.12g，EDTA0.288mg，溶于80ml去离子水中，用0.1mol/L盐酸调Ph7.2，再加水至100ml。三实验用品4)2%叠氮钠液。5)透析液：称取EDTA2.88mg，加入143ml荧光液中，再加无离子水至1000ml，同时加入10ml叠氮钠液。6)10mmol/L氯化钴液。1.超声波法制备脂质体取磷脂液330μl于2.0ml安瓿瓶中，真空干燥20min，再加入荧光液530μl及液530μl，充氮气、封口、漩涡混合器混匀，与超声波清洗机中处理处理10min（电流200~300mA），所得液体即为单层小体积脂质体（SUV）。四实验步骤直径分配率计算：取16μl适当稀释的脂质体液（一般稀释100倍）加在载玻片上，盖上盖玻片，并用凡士林封口，用目微尺观测5个视野里的脂质体直径，记录，按下式计算直径分配率D。D=[X1(0~0.01)+X2(0.01~0.02)×2+X3(0.02~0.03)×3+…]/N其中X1为5个视野里0~0.01μm直径脂质体数的平均值，N为视野数5。包被率计算：取15μl脂质体液稀释液于2985μlTris液中，在荧光分光光度计上测量荧光强度(A)；加入12μlCoCl2液，静置5min，使脂质体外的荧光猝灭，测量膜内荧光强度值（B）；加入150μl10%TritonX-100破膜液，破膜5min，再测量荧光强度(C)。包被率=(B-C)/(A-C)其中A为总荧光强度，B为脂质体荧光强度，C为本底荧光强度。2.冻融法制备脂质体取磷脂液330μl于安瓿瓶中，真空干燥20min，加入Tris液530μl，充氮气，封口，漩涡均匀，超声波处理5min（电流200~300mA），打开瓶口，加入荧光液140μl，氯化钾112mg，漩涡均匀，然后置于干冰-丙酮浴中冷冻1min。取出，室温融解，漩涡均匀。冻融过程重复两次。完成后将脂质体装入透析袋中，在磁力搅拌下对透析液透析2h，换透析液两次（用于与原生质体融合实验时，透析时间与透析配方可与原生质体培养基适当配合），即得单层巨大脂质体（GUV）。直径分配率计算及包被率测定同超声波法。记录测定结果。3.冰冻干燥法制备脂质体取磷脂液330μl于安瓿瓶中，真空干燥20min，加入Tris液530μl，充氮气，封口，涡旋均匀，超声波处理（电流200~300mA）5min，打开瓶口，加入荧光液140μl，涡旋均匀。冰冻干燥10h，取出后加无离子水1ml，涡旋均匀，室温静置1h，超声波处理1min，即得单层大脂质体(LUV)。如需更大体积脂质体可重复冻干过程两次。直径分配率及包被率测定同超声波法，记录测定结果。4.均一脂质体的制备冻融法和冰冻干燥法所制备的脂质体皆可作为DNA、蛋白质或其他较大分子的载体，用于药物运载及与原生质体的融合等。一般来说，作为载体的脂质体在实用前都须经均一化处理。将琼脂糖凝胶4B柱（1×20cm）用Tris液品平衡3倍柱体积（约47ml），流速0.5ml/min，平衡完全后，取脂质体液0.5ml常规上样，Tris液洗脱，洗脱速度0.3ml/min，用核算蛋白检测仪检测洗脱液A280，收集第一峰，即为较均一的脂质体。以A280为纵坐标，洗脱液体积为横坐标，画出脂质体洗脱曲线。1.脂质体的结构及用途如何？2.简述制备脂质体的基本步骤。3.比较超声波法、冰冻干燥法所制备的脂质体的体积，并解释其原因。五思考题