细胞工程知识点总结

《细胞工程》知识点总结一、细胞工程（CellEngineering）：在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。包括：细胞培养、细胞融合、细胞器移植、核质移植、染色体移植、转基因等产品：生物的组织、器官、个体；抗体、多肽药物、蛋白质、酶；天然药物、色素、香精；等二、生物工程包括：发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程。三、1996年Dolly羊的克隆是通过核移植技术，最后在体内生长、分化、发育而成的。四、植物组织培养：在人工培养基上无菌培养整株植物或植物的器官、组织、细胞或原生质体。又称为无菌培养（asepticculture）、离体培养（invitroculture）。五、植物组织培养的类型：1、植株培养（PlantCulture）：在容器（玻璃瓶、透明塑料瓶等）中无菌培养完整的植株。植株来源：由种子无菌萌发而来；通过植物器官、组织、细胞再生而来。在快速繁殖中，后期的成苗和壮苗阶段属于植株培养。（一般时间较短）2、胚培养（EmbryoCulture）：无菌培养植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株。目的：○1促进胚的提早萌发，缩短育苗时间；○2克服远源杂种胚的夭折，以获得新的育种材料；○3在科学研究中，用胚培养所得到的幼苗作为其它试验的材料。3、器官培养（OrganCulture）：无菌培养植物的根、茎、叶、芽、花、果等器官，使其增殖或形成其它的组织或器官等。4、组织培养（TissueCulture）：指无菌培养植物各种组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、皮层、薄壁组织、胚乳等），或由外植体分化形成的愈伤组织（callus），使其增殖或者分化。注：Callus（愈伤组织）：具有旺盛分裂能力，但没有组织和器官分化的细胞群。5、花药与花粉培养：无菌培养植物的花药（带花粉）或花粉，形成单倍体植株。补充：有效的育种辅助手段：单倍体植株获得以后，通过染色体加倍，即得到可以稳定遗传的纯和二倍体，缩短植物育种年限。6、细胞培养：（CellCulture）：无菌培养植物的单细胞或小细胞团。细胞培养可用于：○1植物克隆；○2细胞系的诱变和变异体的筛选；○3生产有用化合物（usefulchemicals）。7、原生质体培养（ProtoplastCulture）：将无细胞壁的原生质体培养成愈伤组织或植株。（注：由于无细胞壁的障碍，原生质体是实现远源植物间大规模遗传物质重组的良好体系。）六、植物组织培养简史1838年：Schwann和Schleiden在细胞学说基础上提出了细胞全能性（totipotency）假说：一个高等生物（动物和植物）身上所有的体细胞(somaticcells)均来自一个共同的细胞——合子(受精卵）；在适当的条件下，一个体细胞应能像合子一样具有发育成一个完整个体的能力。细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。哈布兰特：植物组织培养研究第一人；1902年，德国植物学家Haberlandt根据Schwann和Schleiden创立的细胞学说提出了细胞全能型（totipotency）理论。1934年，美国植物生理学家White由培养番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。1937年，White研配了综合培养基（White培养基），并发现了B族维生素和生长素。1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。1958-1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜素愈伤组织培养中形成了体细胞胚，该实验第一次证明了植物细胞的全能性。1962年，Murashige和Skook发表了著名的植物组织培养基——MS培养基。1967年，Bourgin和Nitsh等通过花粉粒培养获得烟草单倍体植株。七、植物组织培养技术的应用1、植物科学研究的有效手段；2、快速繁育植物的优良品种；3、挽救和保存植物的优良品种，挽救濒危植物资源；4、在植物性状改良上的应用○1胚培养可克服远源杂交不孕的困难；○2花药（花粉）培养可大大缩短育种年限；○3原生质体融合技术可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种；○4单细胞培养技术可用于突变体的筛选；○5植物转基因技术为人们定向、快速改良植物性状、培育新品种提供了方便（但植物转基因必须依赖于植物组织培养技术植物离体再生技术）。5、生产有用物质（usefulchemicals）八、植物组织培养技术的优点1、不受气候、季节和地理位置的影响；2、不受病虫害的影响；3、植物生长发育过程容易调控，容易根据市场需求调节生产；4、效率高、质量好。九、植物组织培养的设施1、试剂与设备◇1化学试剂（用于配制培养基）无机试剂：硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硼酸、钼酸钠等。有机试剂：维生素(B1、B6、烟酸、生物素）、氨基酸、糖（碳源）、植物激素、凝固剂以及其它一些物质。◇2无菌设备○1灭菌锅（autoclave）：最常用消毒的工具。种类多：手提式（如常见的医用消毒锅，体积小）、立式（体积中等）和卧式（有中型和大型）之分；有自热式（带有加热装置）和外热式（无加热装置，需要从外部加热，如煤气、电炉、蒸气等）之分。使用什么样的灭菌锅，要根据植物组织培养的目的和规模而定。○2超净工作台（laminarair-flowcabinet）：用于对植物材料进行无菌操作。超净工作台=空气过滤器，空气经过1-2次粗滤后，最后通过孔径为0.2-0.4μm的滤网。是细胞工程中必不可少的一种设备。超净工作台可以分为双人和单人、单面和双面、水平风和垂直风等类型。○3培养室（Cultureroom）植物材料需要在一个可控温、控光、洁净的地方进行培养。如规模小，则有1-2个培养箱即可。培养箱体积小，不占地方，控温、控光条件好，很适合于摸索植物材料的培养条件和科学研究。缺点是空间小、价格昂贵（7000-10000元/台）。2、培养室所需要的设备○1培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便；○2加温/降温设备：空调；○3光照和控光设备。分为光培养室和暗培养室。光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关。3、培养容器○1玻璃容器：如试管、三角瓶、果酱瓶、罐头瓶、饮料瓶等。玻璃瓶耐高温消毒、透明（便于观察），且为惰性物质，对植物材料的生长影响小，是组培中用得最广的容器，但容易破碎。○2透明塑料容器：轻巧，不易破碎，但不耐反复高温消毒，而且有些塑料容器在高温消毒时会释放一些有害的物质，影响材料的生长。○3容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防止污染和容器内水分的过分散失，又要做到透水、透气。棉塞、锡箔纸、耐高温的塑料纸（如培养食用菌的聚丙烯塑料袋）。其中以棉塞是最好。现在也有专用的封口膜和瓶塞。4、其它仪器和设备○1天平：需要1台万分之一的精密分析天平和百分比之一或十分之一的普通天平。○2冰箱：用于储藏一些不宜在常温下较长时间放置的药品和试剂，如维生素、氨基酸、激素、微量元素等。○3酸度计：植物的生长需要一定的pH值，因此需要对培养基的pH值进行测定、调节。酸度计测定pH值精度高，准确，但比较烦琐。如不是进行要求很高的培养（如单细胞培养、原生质体培养）或进行不同pH值对植物材料生长的影响，可以用pH试纸代替。○4蒸馏水器或者去离子水生产装置○5酒精灯○6解剖刀和镊子○7摇床十、植物组织培养室的设计植物组织培养工作按内容不同可以分为3个的过程：1.培养基的准备:包括试剂的配制、容器的洗涤、培养基的制备与消毒等;2.植物材料的无菌操作;3.植物材料的培养、观察与分析。植物组织培养要求无菌，因此，在设计植物组织培养实验室时既要考虑各环节的衔接，又要避免不必要的交叉，特别是商业化组培苗生产，更要特别注意防止污染。最好是三部分工作相互独立。十一、植物组织培养基1、培养基的组成培养基的重要性：○1植物材料生长的营养来源；○2调节植物材料生长与分化的主要途径。培养基的种类：共同之处：含有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质；不同之处：营养物质的浓度不同。培养基的组分：○1水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水、而不用自来水；○2无机营养成分：大量元素：大量元素：C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,S；微量元素：Fe,Cl,Cu,Mo,B,Zn,Mn；不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大○3有机营养：维生素和氨基酸的总成常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等；其它的维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等；其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等；关于培养基中有机成分的复杂性，要视材料培养难易而定。难培养的材料，则要增加有机成分的种类。○4碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖(lactose,maltose)，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在10—60g/L，一般为20—30g/L。○5植物生长物质：植物激素和植物生长调节剂的总称植物激素：植物合成的、微量就有显著效应的物质。植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类：（1）生长素（Auxins）：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸；生长素的作用：○1促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成；2,4-DNAAIAA,IBA○2控制器官的分化，诱导根的形成；IBANAAIAA（2）细胞分裂素（Cytokinins）：玉米素（ZT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA,BA,BAP）、激动素（KT）;细胞分裂素的作用：○1促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成；○2控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖。（3）赤霉素的生理作用：赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用。在植物组织培养中使用赤霉素主要是促进芽或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，故不宜用高温法消毒。（4）乙烯的生理作用：促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。（5）脱落酸（ABA）的生理作用：促进植物衰老的激素，植物组织培养很少用。在胚状体的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。（6）凝固剂：在植物组织培养中，琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有phytagel,Gelrite,4g/L。（7）有机附加物（Organicadditives）水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3g/L。椰子汁：100-200ml/L。这些物质的成分复杂、不明确，统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些物质往往可以会明显改善材料的生长状况。（8）其他物质：防止与减缓植物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2）吸附剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。活性炭吸附无选择性；改善培养效果、促进生根。PVP专一吸附酚类物质。2、培养基母液的配制为了便于培养基的配制，实际操作过程中可以先将常用的成分配成一定浓度的母液（stocksolution），然后在配各种试验培养基时取一定量的母液稀释。可以配成母液的是无机盐、有机成分和植物激素等。（1）无机盐母液的配制○1大量元素母液的配制：大量元素浓度比较高，故母液浓度(倍数)不能过大，否则溶解不完全，容易析出(特别是冬天)，使用很不方便，一般为20、50或100倍。另一个要考虑的问题是高浓度时有些离子之间发生会发生相互作用，形成沉淀，如SO42-、PO43-和Ca2+之间。因此，在母液浓度较高时，Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。母液浓度高时MgSO4和CaCl2要分开。如把KNO3、NH4NO3和CaCl