四、线粒体的分离与观察

实验四线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心法分离鸡肝脏细胞线粒体的方法。2.学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。二、实验原理线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器，对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。三、实验用品1.材料：鸡肝脏2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B染液、0.25mol/L蔗糖十0.01mo1/LTris-盐酸缓冲液(pH7.4)、0.34mol/L蔗糖十0.01mol/LTris-盐酸缓冲液(pH7.4)、固定液、姬姆萨染液、磷酸盐缓冲液(pH6.8)四、实验操作1.制备鸡肝细胞匀浆:取出肝脏，用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，放入研钵内，剪碎，用预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤两次后，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液（分数次添加），将肝组织研磨成匀浆，用8层纱布过滤备用。2.离心：先将2ml0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入2ml肝匀浆，使其覆盖于上层，标注记号，配平后对称放入离心机中进行差速离心。差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：分离细胞核鸡肝2克匀浆↓匀浆过滤↓滤液↓将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上↓1200r/min离心10min↓↓↓沉淀（涂片①自然干燥）上清液1（细胞核及碎片）↓洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液2ml混匀，2500r/min离心15min）↓↓↓沉淀（涂片②自然干燥）上清液2(与上清液1合并)（细胞核）分离线粒体混合上清液11000r/min离心10min↓↓↓沉淀上清液（弃去）（线粒体）↓洗涤(加0.25mol/L预冷蔗糖溶液10ml混匀,11000r/min离心10min）↓↓↓沉淀（涂片③自然干燥）上清液（线粒体）3.分离物鉴定(1)细胞核：取细胞核沉淀1滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。(2)线粒体：取线粒体沉淀1滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B染液染20min，覆上盖玻片，镜检。结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。五、实验报告1.分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)2.描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的纯度如何?六、实验建议1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。