果蔬中营养成分含量的测定 绿豆芽黄豆芽

果蔬中营养成分含量的测定（绿豆芽、黄豆芽）12生科本实验内容及结果：一、果蔬中维生素C含量的测定实验原理：还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。器材：微量滴定管及架、台秤、50mL量筒、1mL、10mL吸管、100mL锥形瓶、剪刀、滤纸操作：1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称20.0g橘子放入50mL量筒中，加2%草酸液至40mL刻度处（即稀释1倍）。用玻璃棒搅拌，静置10分钟，过滤，滤液即是（若样品中含大量铁，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓Fe2+还原染料）。2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。3、滴定维生素C标准液：吸取1.0mL维生素C标准液放入锥形瓶中，加9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出1mL染料相当于多少mg维生素C。4、滴定样品液：吸取10.0mL样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。实验结果：标准维生素c溶液所用染料/ml绿豆芽所用染料/ml黄豆芽所用染料/ml0.20ml0.23ml0.12ml计算：M绿豆=100WCV=2.3mgM黄豆=100WCV=1.2mg每100g黄豆芽中维生素c含量2.3mg，每100g绿豆芽中维生素c含量1.2mg结果讨论：资料显示，100g绿豆芽VC含量为6.0mg，100g黄豆芽VC含量为8.0mg。与测出的数据有出入。原因有以下这些：①、绿豆芽和黄豆芽不新鲜，导致水分流失，从而使VC流失，使数据偏小②、豆中含有部分VC使因没有碾磨完全导致残留渣中含有VC，使数据偏小③、草酸于碾磨之后才加，碾磨过程中有部分液体溅出使VC流失数据偏小④、碾钵中有残留的VC使测出的数据偏小。二、果蔬中总糖及还原糖含量的测定——蒽酮比色法原理：蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。实验仪器：分光光度计，水浴锅，电炉，试管10支，电子天平，研钵，100ml容量瓶，量筒和三角烧瓶若干，过滤仪器操作：1、葡萄糖标准曲线的绘制：取洁净试管6支，按表1进行操作：表1蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作012345标准葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸馏水1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮试剂4.04.04.04.04.04.0煮沸10′，冷却后室温放置10′，在620nm处比色A620nm以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温约管号步骤0.5h（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100mL。过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液0.5mL→100mL；梨：取滤液1mL→100mL；盘菜、萝卜取滤液10mL→100mL。取1mL最终稀释液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。3、样品中总糖的提取、水解和测定称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL，过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液0.5mL→200mL；梨：取滤液5mL→100mL；盘菜、萝卜：取滤液10mL→100mL。取1mL总糖的最终稀释液同上法进行还原糖测定。数据记录：绿豆芽还原糖比色值：0.184黄豆芽还原糖比色值：0.081绿豆芽总糖比色值：0.371黄豆芽总糖比色值：0.283计算：Anm62000.1770.2420.3710.5090.624绿豆芽W(还原糖)=mVC=8.246%黄豆芽W(还原糖)=mVC=2.233%绿豆芽W(总糖)=mVC=9.063%黄豆芽W(总糖)=mVC=3.574%结果讨论：实验测量出的数据与理论值有些偏差，存在偏差原因：①、豆芽的豆研磨不完全，豆内含糖量较高，导致结果偏小②、水浴之前反应物未摇匀，导致反应不完全，使得比色法结果不准确。三、果蔬中蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）原理：考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。器材：可见光分光光度计、旋涡混合器、试管16支操作：1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。管号试剂012345100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸馏水／mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液／mL5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mLH2O或0.05mol/LTris－HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15～20min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。实验数据：Anm59500.1610.2070.2940.3950.412绿豆芽黄豆芽样品/ml1.01.0考马斯亮蓝/ml5.05.0OD值0.4451.036计算：100g绿豆芽含蛋白质0.45g（理论值为2.1g）100g黄豆芽含蛋白质1.1g（理论值为11.5g）结果讨论：实验证明，绿豆芽的蛋白质质量小于黄豆芽蛋白质含量，但测量值远远小于理论值，出现这种现象的原因：豆芽在发芽前几天蛋白质含量最高，在发芽过程中部分蛋白质会分解为各种氨基酸，所以含量偏小。操作误差：①、研磨成匀浆时转液未彻底，研钵中有剩余②、离心过程中由于仪器的问题未完全离心，所以离心了两次，但最终蛋白质分布依然不均匀。四、果蔬中过氧化物酶分析（聚丙烯酰胺凝胶电泳）原理：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。实验仪器：垂直板电泳槽及其附件，电泳仪，高速离心机，250ml烧杯4个，100ml，10ml，5ml量筒各若干，玻璃棒，培养皿等操作1.贮液配制2.电泳槽的安装3.制胶（1）配制分离胶（2）配制浓缩胶4．样品的制备5．点样6．电泳7．剥胶8．染色、记录结果实验结果：浓缩胶到前沿指示剂的距离：6.7cm分离胶到前沿指示剂的距离：8.9cm黄豆芽到分离胶上沿距离：2.8cm绿豆芽到分离胶上沿距离：2.4cm3.0cmRf黄豆芽=2.8cm/8.9cm=0.314Rf绿豆芽1=2.4cm/8.9cm=0.270Rf绿豆芽2=3.0cm/8.9cm=0.337结果讨论：封胶时一定要等琼脂完全凝固后再上分离胶；为防止酶失活，制作的果蔬不使用时及时放入冰箱。染色的时候放入黑暗中不及时，导致了染色较浅，点样时注射器将样品液注射入样品槽内，部分样品液滴入电容缓冲液中不利于观察酶带的位置五、过氧化物酶活性的测定（比色法）实验原理：在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。仪器设备：分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100mL容量瓶，吸管，离心机。实验步骤1.取上述的样品提取液2.5mL，定容至50mL刻度，备用。2.取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次。数据记录：比色皿时间绿豆芽黄豆芽1min后0.1700.4922min后0.2040.6623min后0.2340.8764min后0.2551.1085min后0,2741.575OD差值平均值0.0260.270过氧化物酶活力=DODt01.0min5值的差内，其中D=1，t=5min；绿豆芽中过氧化物酶活力=2.6;黄豆芽中过氧化物酶活力=27过氧化物酶比活力=DODWt01.0min5值的差内，其中W=1g；绿豆芽中过氧化物酶比活力为2.7u/(g*min);黄豆芽中过氧化物酶比活力为28u/(g*min);结果讨论：黄豆芽中过氧化物酶活性比绿豆芽中过氧化物酶活性大。存在误差原因：黄豆芽材料比绿豆芽新鲜；在低温中保存不及时，导致活性降低；离心仪器的问题导致离心结果不佳，分布不均匀，黄豆芽和绿豆芽之间离心结果也有偏差，导致了酶活性的偏差；整个实验时间较长，导致过氧化物酶被氧化变质。果蔬成分分析实验总结：做好一个实验，在每一步都需要谨慎仔细，这样实验测出来的数据才更科学更实际。在这次的果蔬成分分析实验中，首先要选好材料，选择新鲜的材料很关键，在果蔬的生长代谢过程中其含量不断地发生着变化，所以要选好材料。称量少量果蔬时果蔬的选择部位也很关键，必须要符合实验要求，取材均匀，拿黄豆芽来说，我们测量黄豆芽的成分含量，若取材完全取豆或者完全取芽部分都是不当的，豆中的含量和芽中的成分含量相差甚远，这些都会使实验数据失去科学性。称量完之后应快速实验，防止各成分含量缺失。研磨的时候注意不能用力过猛，导致汁液飞溅，碾磨时必须彻底，尤其是豆部分比较坚硬，必须研磨成糊状或液状，转移之后应润洗碾钵，将残留物完全转入样品中。在具体的实验过程中，应规范操作，测量、滴定、移液、过滤等都需谨慎。比色的时候若样品比色结果远远超出标准曲线范围，因增加稀释度重新测量。由于外界空气的影响，易被干扰氧化或者变质的溶剂必须在倒出后尽快使用或反应。过氧化物酶活性测定时，考虑到0号对照溶液标准液和样品必须相同，而且溶液易被空气氧化，必须快速实验，减少误差。凝胶电泳实验时电泳槽安装不得过紧，这样会使梳子插不进去，封胶时一定要等琼脂完全凝固后再上分离胶，防止分离胶漏出，点样时一定注意用注射器将样品液注射入样品槽内，若大量样品液滴入电容缓冲液中会影响最后的染色，不利于观察酶带的位置。最后处理数据的时候一定要了解实验原理了解实验过程，尤其是稀释次数多时思路需清晰，防止出现数据处理失误。总而言之，做好一个实验首先要严谨的态度，然后是严谨的思路，严谨的操作方式，严谨的结果分析，这样一个实验才会更科学。