5食品微生物检验的基本程序

本章的主要内容一．食品微生物检验的一般步骤二．检验前的准备三．样品的采集四．样品的送检五．样品的处理方法六．致病菌检验参考菌群的选择七．样品的检验八．检验结果的报告一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告二.检验前的准备1.准备好所需的各种仪器。2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3.准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基。4.做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min.5.工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。6.工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。三.样品的采集（一）采样的目的和意义1.便于食品卫生质量监督管理2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质。3.为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。（二）样品的种类1.大样，就是一整批；2.中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；3.小样，也称检样，做分析用的，一般为25g。（三）采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明（四）采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。（五）食品微生物检验的采样方案1、食品卫生学微生物检验的取样方案检验目的：检验食品的微生物卫生指标是否合格。取样方案有：①ICMSF取样方案；②美国FDA的取样方案；③世界粮农组织（FAO）取样方案；④我国的食品取样方案。一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样；进出口贸易合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案。目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案，有时也可参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单位包装件数N的开平方值抽样。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。ICMSF推荐的抽样方案ICMSF的采样设想及其基本方法用于分析所抽样品的数量、大小和性质对结果会产生很大影响。在某些情况下用于分析的样品可能代表所抽“一批”（lot）样品的真实情况，这适合于可充分混合的液体，如牛奶和水。在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”容易包含在微生物的质量上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方案之前，必须考虑诸多因素（ICMSF，1986），包括：——检验目的——产品及被抽样品的性质——分析方法ICMSF提出的采样基本原则，是根据（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。（2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。目前，加拿大、以色列等很多国家已采用此法作为国家标准。在进行详细叙述之前，先解释四个代号：n：系指一批产品采样个数。c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。1．ICMSF的采样方法有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、с及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。（1）二级抽样方案。自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。以生食海产品鱼为例n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。（2）三级抽样方案。设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许≤3个检样的菌数是在m;M值之间，如果有3个以上检样的菌数是在m;M值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。（3）．ICMSF对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明为了强调抽样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。级别危害程度对象微生物食品经不同处理后的危害度减少（加热））无变化（冷冻品立刻进食增加危害度（未加热吃到吃前还有一段时间）三级方案1.食品的保藏2.轻度间接指标菌3.中度程度局部传播细菌数大肠菌群大肠杆菌金黄色葡萄球菌（指标菌）金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌产气荚膜梭菌n=5c=3n=5c=2n=5c=1二级方案1.中度程度广泛传播2.严重程度沙门氏菌副溶血性弧菌致病性大肠杆菌肉毒梭菌霍乱弧菌伤寒沙门氏菌n=15c=0n=30c=0n=60c=0注：表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。三、抽样方法确定了抽样方案以后，抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性代表性至关重要。抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有：1、常见的抽样方法有：1）、重量法采取一定重量的食品作为一个样品。采取屠宰后两腿内侧肌或背最长肌100g/只；蛋、蛋制品样品，每份不少于200g；见（书后）。2）、拭子法拭子法采样不损害肉的完整性，操作简便。但是检出的活菌总数不高。2、按照采集对象特点不同，常见的抽样方法有：1）．直接食用的小包装食品：尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。2）．桶装或大容器包装的液体食品：（1）．抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；（2）．抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品，装人灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀；（3）．取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；（4）．如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0-4℃。2、食物中毒微生物检验的取样检验目的：查找食物中有何病原菌。3、人畜共患病病原菌检验的取样检验目的：鉴定畜禽及其产品是否带有人兽共患的病原菌。（六）食品微生物检验采样方法采样原则：能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.1、液体样品采样方法充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.2、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。3、固体样品采样方法大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。5、生产工序监测采样①车间用水：从车间各龙头采样；②车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。③车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。平皿（七）采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。×××××采样单样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品名称（商品名）______规格型号__________注册商标_____________生产厂家_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□受检地点_______________通讯地址__________邮政编码□□□□□□采样地点_______________采样日期__________采样基数______________生产日期_______________批号__________产品依据标准__________有效成分及含量____________________________________________________________检验目地________________检测项目_____________________________采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章）签字签字日期年月日日期年月日备注四.样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。五.样品的处理方法（一）液体样品（二）固体样品（三）冷冻样品(一)液体样品的处理1.瓶装液体样品的处理2.盒装或软塑料包装样品的处理1.瓶装液体样品的处理用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1.捣碎均质法2.剪碎振摇法3.研磨法4.整粒振摇法5.胃蠕动均质法1.捣碎均质法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。2.剪碎振摇法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3.研磨法将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4.整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻