Trizol法提取组织总RNA步骤

1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。再向研钵内倒入适量液氮。从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。2.Trizol法提取RNA1)室温静置3-10min，使蛋白质变性；2)加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。（核蛋白复合体彻底裂解）3)吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4)加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）5)加入100ul70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。6)弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。7)加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。8)分光光度计检测RNA浓度和OD值，将TotalRNA稀释至1ug/ul，备用。