维生素B12的发酵

维生素B12的发酵及应用吉韬（201031012610生物技术）摘要：本文综述维生素B12的基本性质，生物合成途径以及发酵生产工艺，并对B12的应用与市场前景做了分析关键词:维生素B12发酵提取抗生素一、引言维生素B12是一种水溶性维生素。只需少量即能产生效果，为深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素（redvitamin）或氰钴胺。维生素B12具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。其计量单位为微克（mcg——microgram，即1/1000000克）。二、正文1.结构与性质维生素B12（VB12）为钴胺素（Cobalamin）类化合物，他的分子中有4个还原性吡咯环联结在一起，这种构叫做咕啉，他与核苷酸（二甲基苯异咪唑）及核糖相联，另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连，钴与核苷酸之N相偶联。化学上称氰钴胺素为维生素B12，除CN后称钴胺至少。CN可为其他基团代替，成为不同类型的钴胺素。一般称对哺乳类有生理作用的为钴胺素，称对哺乳类及微生物都有作用的为维生素B12。本文中维生素B12泛称此类物。氰钴胺至少自然界很少，为人工合成产品，可从其他类型转换而来。他是红色结晶，其活力为重金属及氧化还原剂所破坏，但在短期高压消毒（12℃）不被破坏，能溶解在1：80水中，溶液为中性，在PH4.5～5时最稳定。辅酶B12（即5‘-脱氧腺钳钴胺素）及甲基B12（甲基钴胺素）为哺乳类（人类）组织中最主要的辅酶形式。前者在线粒体内，后者在胞浆内，为合成蛋氨酸所必需者。它们对光不稳定，光解后形成水钴胺素。在氰存在下变成氰钴胺素，维生素B12、B12a、B12b、B12c都可治疗维生素B12的缺乏。氰钴胺素分子式（CN可以其他基团代替）氰钴胺素分子式（CN可以其他基团代替）2.主要功能1）是提高叶酸利用率，与叶酸一起合成甲硫氨酸（由高半胱胺选合成）和胆碱，产生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基先驱物质如甲基钴胺和辅酶B12，参与许多重要化合物的甲基化过程。维生素B12缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导叶酸缺乏症2）是维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏维生素B12时，可引起神经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。维生素B12缺乏可导致周围神经炎。小孩缺乏维生素B12的早期表现是情绪异常、表情呆滞、反应迟钝，最后导致贫血。3）是促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有关。4），是维生素B12还参与脱氧核酸（DNA）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。3主要用途3.1医疗方面①用于治疗和预防维生素B12缺乏症。②用于胃切除或吸收不良综合症，维生素B12缺乏造成贫血的预防。③用于补充因消耗性疾病，甲状腺机能亢进，妊娠，哺乳等造成的维生素B12需求增加。贫血。⑥肝障碍贫血。⑦放射性引起的白细胞减少。⑧神经疼，肌肉疼，关节疼。⑨末梢神经炎，末梢神经麻痹。⑩脊髓炎，脊髓变性。3.2饲料添加剂维生素B12对于机体生长是一种不可缺少的微量营养物质，大多数动物的植物性饲料中不含维生素B12，动物一方面靠胃肠中的微生物合成，一方面靠外界添加。为了满足动物维生素的需要就必须补充维生素添加剂。猪和鸡等非反刍动物缺乏维生素B12主要表现是生长发育停滞，也有少数猪可出现轻度的正常红细胞性贫血。此外，还可使鸡的孵化率和猪的生殖率降低。缺乏症的临床症状包括食欲不振、生长停滞、单纯贫血，严重的也有神经症状。饲料维生素B12能促进家禽，特别是幼禽幼畜的生长发育。可用于：①维生素B12缺乏所引起的猪、鸡生长发育不良和贫血；②缺钴地区牛、羊所出现的地方性消瘦病；③神经炎、神经痛等的非特异性治疗；④提高饲料蛋白的利用率；⑤经济动物的饲养；⑥用B12溶液处理鱼卵或鱼苗，可提高鱼对水中有毒物质如苯和重金属的耐受力。3.3其它①食品添加剂②可作为仪器着色剂：如火腿，香肠，冰淇淋，鱼肉酱。③用于化妆品，肥皂，牙膏等，也可用于厕所，冰箱，口腔等防臭，消除硫化物和醛的气味。4、维生素B12的发酵生产（一）抗生素废液中提取早在1952年美国T.R.Wood等人就发现,当用加有钴化合物的培养基培养灰色链霉菌时,可大大提高维生素B12在整个培养液中的浓度,但是对于钴化合物的浓度要求要适量,过高的浓度会对菌体细胞产生毒性;另有研究表明,添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液中B12类似物的含量,但需严格掌握其用量(二)放线菌发酵自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素B12后,许多科学家将目光转向了采用放线菌,其中主要是链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12,而于链霉素的生成,而始终未能使得维生素B12的产生处于主导地位,因此,我们应选出链霉素发酵支路的关键酶,并将其抑制,这样便可大大提高维生素B12的得率,使得大量产生维生素B12成为可能（三）下水道废液中提取采用生物活性污泥法处理的废水中,通常含有多的B12,干的活性污泥可先用水浸提,然后过滤掉固形颗粒,之后可分离、纯化B12，此得到的B12有如下特点:1、无需前培养,这样大大减少了前期投入;2能耗大,尤其是浓缩这一关键性步骤将造成大的能量损耗;3、用此法得到的B12的浓度虽并不低,但受活性污泥这一来源的影响,由此获得的B12并不能直接进入食品或药品级产品,而通常只局限于饲料添加剂（四）丙酸菌发酵[(五）巨大芽孢杆菌生产VB12以巨大芽孢杆菌为例,将培养基用氨水调至pH7.0,发酵液需要连续不停地搅拌和大量通气,温度需控制在30℃左右,每隔一定时间需用5%的氨水来调pH,同时需定期补充碳、氮源,以期达到最高产量(六）采用转基因的发酵生产目前,人们对于B12的控制基因已经非常清因此,这就使得将其转入大肠杆菌,以期大量生产,但该方法真正用于大生产还有待时日,即使用于生产,也会不可避免地存在这样的问题,如导入的质粒不能稳定地遗传下去,会随发酵条件的变化而脱落等,因此,就近些年,维生素B12的生产仍需按传统发酵来完成5、维生素B12的提取对于维生素B12提取,不断有新的方法提出,主要有两种,一种为溶剂提取法,另一种为离子交换树脂法(一)有机溶剂提取研究表明,采用两相混合溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液,基本过程如下:发酵液—吸附(活性碳)—洗脱(吡啶)—浓缩—层析(Al2O3)—洗脱(甲醇)—收集红色液—浓缩—结晶（二）离子交换树脂法离子交换树脂法提取随着离子交换柱在工业上的广泛应用,人们尝试用阴阳离子交换树脂来进行维生素B12的提取,并取得了较好的效果,过程如下所示:发酵液—阳离子树脂(LonacC-240)—阴离子树脂(LonacAC-300)—蒸馏水冲洗—收集红色液体部分—浓缩—冷冻干燥86、目前维生素B12发酵生产面临的问题及今后的发展方向针对目前国内维生素B12的发展状况,提出如下的发展方向:（1）搞好维生素B12发酵菌株的选育工作,同时可借助于紫外线诱变、原生质体融合等生物技术工程手段,提高单株的产量（2）进行高密度培养,首先增加生物量,以期提高单位发酵效率;（3）由于目前关于维生素B12的代谢途径和基因表达序列已基本研究清楚，因此,可采用基因工程手段,使该基因片段能在宿主细胞中多次表达,并使其能稳定遗传,将会是维生素B12发酵的一大革命;（4）研制新型的诱导剂,以进一步提高其产量;（5）研制高效专用的生物反应器,采用连续流加培养;（6）采用固定化技术,将菌种包埋或吸附于载结束语发酵周期过长、菌体量和产物积累量不一致,都直接导致了维生素B12的生产成本过高。高产菌株的获得是发酵生产的关键,在改进发酵工艺的同时,对生产菌的育种工作也备受关注,目前利用传统方法诱变育种和基因工程育种的研究方兴未艾。维生素B12是微生物次级代谢产物,反馈调节机制对菌体中维生素B12的积累具有重要作用。只有进行详尽代谢工程研究,才能真正做到定向改造菌种,最终达到解除反馈抑制、提高维生素B12产量的目的。相信随着实验技术的不断改进,维生素B12合成机制将会完全阐述.参考文献1罗,郝常明1维生素B12的研究及其进展[J]1中国食品添加剂,2张玉明，王雷，王云山，张利平，苏志国维生素B12的生物合成研究3刘志伟著.补血功能食品.化学工业出版社,2005年03月第1版.