外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录

外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录实验内容人外周血单个核细胞总RNA的分离和纯化。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。外周血单个核细胞分离的原理•人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。•单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出PBMC。外周血单个核细胞的分离实验步骤1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入5ml塑料试管；2.取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入到淋巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）；3.2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞)；4.吸弃最上层血浆，再吸取单核细胞层至一新的5ml塑料试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm，5min；5.吸弃上清，加生理盐水500ml轻柔吹打混匀后，转入1.5mlEp管中，2500rpm，5min；6.吸弃上清，留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。酸性酚法抽提RNA的原理苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。1.焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。2.异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性。抑制RNA酶活性的试剂注意事项——预防RNase污染1.人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细菌，而霉菌有可能成为RNase来源。2.要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染。3.RNA在Trizol中不会被RNase污染，我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。单核细胞中总RNA提取实验步骤1.在上述Ep管中加入500ul变性液（Trizol:苯酚+异硫氰酸胍）悬浮细胞，加100ul氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴10min。2.4℃，12000rpm，离心10min。吸取上层无色水相(含有RNA)转入新的1.5mlEp管中，加入等体积异丙醇，-20℃，15min。3.4℃，12000rpm，离心10min。去上清，加入500ul70%乙醇（不吹打！）4℃，12000rpm，离心10min，去上清，烘干。4.加10ulDEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。逆转录-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核细胞中表达。完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶，适当的反应缓冲液，RNA模板，逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。实验步骤——逆转录逆转录反应体系：MgSO42ml2×bcastBuffer5mldNTP0.5mlRNasin0.5mlRandomprimer0.5ml样品总RNA1.5ml总体积10ml反应条件：65oc1min30oc5min30oc-65oc15min--30min(匀速升温）98oc5min5oc5min实验步骤——PCR扩增反应体系：10×Buffer2mlMg2+1.5mldNTP2mlcDNA5mlTaq0.2mlprimer2mlddH2O17.3ml总体积30ml反应条件：94℃5min94℃45s56℃30s72℃30s72℃5min4℃保存×30c结果与分析PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条带，非目的条带。具体实验结果分析，如果实验失败，请分析原因，按实际实验出发。