CRISPR-Cas系统与植物基因编辑

CRISPR-Cas系统与植物基因编辑Cas9目录CONTENTS01CRISPR-Cas9基因编辑技术02CRISPR-Cas9与植物基因编辑03四种介导的植物基因编辑技术04参考文献CRISPR-Cas9基因编辑技术01CRISPR/Cas的分类CRISPR/Cas9技术优势CRISPR/Cas9作用原理CRISPR/Cas结构基础CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas结构基础CRISPR/Cas系统由多个重复序列(repeat)与非重复间隔序列(spacer)构成的R-S结构及编码Cas的基因操纵子组成，其中R-S结构能够特异性识别外源性DNA，并由类似于启动子的CRISPR前导序列起始转录生成crRNA前体。Cas基因家族负责编码具有多种功能的CRISPR相关蛋白质，并通过tracrRNA(trans-activatingcrRNA)将crRNA前体修饰为成熟的crRNA并与crRNA协同作用，共同构筑细菌的免疫屏障。CRISPR-Cas9基因编辑技术细菌体内的CRISPR/Cas9免疫系统的作用机制可分为以下三步：CRISPR间隔序列的获取、crRNA前体的转录与crDNA的加工、crRNA与tracrRNA及Cas9蛋白结合成复合体对外源性DNA进行剪辑。。根据该机制，Wiedenheft等设计出的CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术的核心过程为：根据crRNA与tracrRNA的二聚体结构设计出sgRNA，将之与Cas蛋白结合，引导Cas蛋白与特定基因位点结合并进行剪辑。该设计将CRISPR/Cas9免疫系统简化为sgRNA与Cas蛋白的复合体，只需将其导入细胞，即可对目的基因片段进行定点编辑，这极大地简化了CRISPR/Cas9基因编辑技术。CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas作用原理由tracrRNA-crRNA-Cas9复合物识别外源性DNA，其中Cas9蛋白在crRNA互补链PAM元件上游3nt与非互补链PAM元件下游的3~8nt处对DNA双链进行剪辑。类型IICRISPR-Cas9基因编辑技术多个Cas蛋白与crRNAs结合形成cascade(CRISPRassociatedcomplexforantiviraldefense)-crRNA，其识别外源DNA与含有PAM(protospaceradjacentmotifis)元件的位点特异性结合，并介导Cas3蛋白对目标DNA进行剪辑。类型I不需要PAM的情况下，Cas6/Cas10作用于crRNA前体，形成crRNA并与之结合后，识别并破坏外源性DNA。类型IIICRISPR/Cas分类CRISPR/Cas技术优势CRISPR-Cas9基因编辑技术与ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9系统能更好地识别靶基因，且CRISPR/Cas9系统由crRNA和Cas9蛋白组成，结构简单，仅需构建一对引物。因此该基因编辑技术具有更高的编辑效率、更简单的操作、成本低、编辑范围广等优势。CRISPR-Cas9与植物基因编辑02双子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术21单子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术拟南芥烟草大豆番茄马铃薯15324CRISPR/Cas技术在双子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术拟南芥拟南芥作为模式植物，对其研究最多也基本是最先开始的。2015年，Ma等制备了由AtU3和AtU6启动子驱动的1-3个sgRNA表达盒的4个基于pYLCRISPR/Cas9P35SH的构建体，用于在拟南芥中靶向基因；使用农杆菌浸润（花卉浸渍）方法转化，而后分析了拟南芥T1代的靶向编辑情况，在118个测序位点中，检测到42个（35.6%）突变，且这些突变是可遗传的。CRISPR-Cas9基因编辑技术烟草烟草也是常用的模式植物。2015年Gao等也对PDS基因进行了实验的同时，还对独脚金内酯转运蛋白PDR6基因进行定点编辑，在烟草的原生质体中获得16.2%-20.3%的突变率。在烟草中的基因定点编辑无论是叶片还是原生质体都有取得突变，但没有获得可供稳定遗传的植株，需要进一步的研究来解决。CRISPR-Cas9基因编辑技术大豆大豆是重要的粮食作物.2015年Sun等针对大豆的Gm06g14180、Gm08g02290和Gm12g37050基因设计靶位点，分别用拟南芥的AtU6启动子和大豆的GmU6启动子驱动gRNA，获得了3.2%-20.2%的突变率且使用大豆GmU6启动子比拟南芥AtU6启动子的打靶效率更高；其内源的启动子也可以驱动gRNA实现定点突变。结果证明CRISPR/Cas9系统可以对大豆的外源导入基因及内源基因进行定点基因编辑。CRISPR-Cas9基因编辑技术番茄番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一，应用广泛。2015年Ito等针对番茄RIN基因，即编码调控果实成熟的MADS盒转录因子设计sgRNA构建载体进而转化番茄的子叶；在T0再生植物中的Cas9切割位点发现3个以上的碱基插入或缺失的突变；RIN蛋白缺陷突变体产生不完全成熟果实，其中红色色素沉着显著低于野生型，而其余野生型基因的异源突变体达到全熟红色，证实了RIN在成熟中的重要作用；且在3个独立靶位点产生的几个突变能在T1后代中遗传，证实了该诱变系统在番茄中的适用性。以上在番茄中的实验也都说明该技术可以成功应用在番茄上，可以产生稳定遗传种系，对于番茄的新品种选育有着重要意义。CRISPR-Cas9基因编辑技术马铃薯2015年，Wang等为了测试马铃薯自身的U6启动子是否能够促进sgRNA的表达，首先在烟草中用该启动子驱动PDS基因转化叶片，2d后提取DNA进行检测发现有碱基的缺失和插入，结果表明马铃薯的U6启动子对于本氏烟草中的靶向诱变是有效的；然后靶向马铃薯中的StIAA2基因，产生12个T1转基因植物；使用靶序列侧翼的引物对6个代表性的T1植物进行PCR来检测是否在转基因马铃薯植物中产生了StIAA2突变，产物克隆测序后显示其中两个植物是2或18bp缺失的单等位基因纯合突变体。通过这种方法，可以在T1代中获得单等位和双倍体纯合突变体.因此，CRISPR/Cas9系统是开展马铃薯中非特异性基因功能研究的有效工具.。CRISPR-Cas9基因编辑技术水稻小麦玉米高粱矮牵牛CRISPR/Cas技术在单子叶植物中的应用CRISPR-Cas9基因编辑技术水稻水稻是人类的主要粮食作物，选育优良和高产量的品种有助于解决世界上人口与粮食不足的问题.而且水稻也是单子叶植物中的一种模式植物。2017年，沈春修靶向水稻的LOC_Os10g05490基因，将构建的重组质粒利用电激法转化到农杆菌中，并转化水稻胚性愈伤组织，最后获得高达76.5%的转化率。CRISPR-Cas9基因编辑技术小麦小麦是多倍体植物，常规的杂交育种局限较大，新型的基因编辑技术可以简便快捷。同年，Shan等靶向小麦的LOX2基因，设计的sgRNA约30%起作用，其因可能是复杂的基因组背景。普通小麦是一种六倍体物种，多数基因由基因组A、B和D中的同源拷贝代表，因此一个基因座中的单基因敲除通常由于功能冗余而不能引起实质的表型变化。所以可以有望利用此技术实现多基因的同时删除或替换，以此改变其功能进而影响其表型的变化。CRISPR-Cas9基因编辑技术玉米TaU3.分析表明玉米密码子优化的Cas9表达明显优于两个人密码子优化的Cas9基因.TaU3启动子似乎比OsU3启动子略好，OsU3启动子表现比AtU6-26启动子好得多。为测试该载体的靶向突变效率，生成了一个pCAMBIA衍生的CRISPR/Cas9二元载体，其中两个gRNA表达盒靶向同一玉米基因ZmHKT1的两个相邻位点.转化玉米未成熟胚，在其长成幼苗时，分析了20个T0转基因株系，发现超过60%的转基因品系对于两个靶位点具有约100%的突变效率。从突变效率约为100%的植株中选取两个克隆并测序PCR片段，发现两个靶位点之间存在几十bp片段的缺失。该实验证明了Cas9和启动子的不同对编辑效率的的影响不同。CRISPR-Cas9基因编辑技术高粱2013年，Jiang等构建了编码错码的红色荧光蛋白基因DsRED2的载体.用农杆菌介导法转化高粱未成熟胚，观察到稳定转化的GFP阳性组细胞中约1/3（5/18）含有DsRED2片段。这种情况表明仅在表达GFP基因的细胞的一个或多个分裂之后发生NHEJ反应，因此，这一部分表明Cas9/sgRNA定向基因切割和NHEJ发生在稳定整合到植物细胞染色体的基因中。CRISPR-Cas9基因编辑技术矮牵牛矮牵牛是一种重要的观赏植物.牵牛花中PDS是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。2016年，Zhang等在PDS相差745bp的两个外显子上设计靶位点sgRNA1、sgRNA2，用经过植物密码子优化过的Cas9构建载体，进而转入农杆菌并侵染幼叶，而后进行表型观察和筛选，在靶位点1检测到的152个植物中109个表现为白化，24个白绿相间，突变率为87.5%，在靶位点2检测到的62个植物中28个表现为白化，8个白绿相间，突变率为55.6%。四种不同介导的植物基因编辑技术03CRISPR-Cas9基因编辑技术四种介导的植物基因编辑NHEJ介导的基因敲除HR介导的基因定点插入或替换CRISPR-Cas9系统介导的基因激活和干扰CRISPR-Cas9基因编辑技术NHEJ介导的基因敲除实际应用中，有些植物的性状通常由多个基因控制，而传统的获得多基因突变体的方法费时费力，ZFN和TALEN技术在靶点设计上的繁琐也限制了其同时敲除多基因的功能。因此，利用CRISPR-Cas9技术对多基因的敲除更显其优越性。多基因的敲除的核心问题在于多靶点，因此只要解决了多个sgRNA表达框的问题就可将问题简化。CRISPR-Cas9基因编辑技术HR介导的基因定点插入或替换己知一些作物由单一SNP(singlenucleotidepolymorphism，SNP)或少数几个SNP来决定其品种或生态型的性状差异。尽管基于同源重组修复途径的基因组编辑技术应用潜为巨大，但与NHEJ随机的引入、删除或替换不同，HR修复方式需要有外源供体片段为模板进行精确修复，这种修复途径的发生概率是非常低的。CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR-Cas9系统介导的基因激活和干扰早期相关CRISPR-Cas9系统的报道都是进行基因的敲除，但是很快，科研人员就发现了CRISPR-Cas9系统的新功能，即巧Ｗ激活或者干扰祀基因的表达。科研人员对Cas9蛋白进行了改造，在破坏Cas9蛋白的切割功能（即破坏HNH核酸酶结构域和RuvC-like结构域）的同时不影响其在sgRNA的引导下与靶向DNA的结合，这种被改造的Cas9称为dCas9。在Cas9蛋白上结合抑制子或激活域，就可完成对目的基因的干扰或激活。CRISPR-Cas9基因编辑技术Cpf1在基因组编辑中的应用CRISPR-Cas系统发挥功能所依赖的Cas蛋白具有多种类型，除去已熟知的依赖Cas9蛋白的Ⅱ型CRISPR-Cas9系统外，2015年一种更小的Cas蛋白被发现于金黄色葡萄球菌中，它属于Ⅴ型CRISPR-Cas系统。该系统与Ⅱ型CRISPR-Cas9系统相似，只需要一个效应蛋白就可以发挥切割作用。参考文献04CRISPR-Cas9基因编辑技术参考文献[1]邢慧丽.CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用[D].中国农业大学,2017.[2]马兴亮,刘耀光.植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析[J].遗传,2016,38(02):118-125.[3]平文丽,李雪君,林娟,丁燕芳,孙焕,孙计平.CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用[J].中国农学通报,2016,32(05):16-22.[4]谢亚磊,刘千琪,刘戟.CRISPR/Cas9基因编辑技术最新研究进展[J].生命的化学,2016,36(01):1-6.