您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 项目/工程管理 > Primer-BLAST-NCBI-的引物设计和特异性检验工具
Primer-BLAST:NCBI的引物设计和特异性检验工具一、Primer-BLAST介绍Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物。Primer-Blast可以直接从Blast主页()找到,或是直接用下面的链接进入:这个工具整合了目前流行的Primer3软件,再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤,设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且,Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能,这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。二、Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分:targettemplate(模板区),theprimers(引物区),和specificitycheck(特异性验证区)。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。(1)模板(Template)在“PCRTemplate”下面的文本框,输入目标模板的序列,FASTA格式或直接用AccessionNumber。如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificitycheck区选择)是唯一的。(2)引物(Primers)如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏。可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificitycheck区选择)。根据需要可设置产物的大小,Tm值等。(3)特异性(Specificity)在specificitycheck区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库:RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selectedreferenceassemblies包括以下的物种:human,chimpanzee,mouse,rat,cow,dog,chicken,zebrafish,fruitfly,honeybee,Arabidopsis,和rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。三、实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNAglycosylasegenes,UNG,GeneID:7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点(NM_003362),UNG2的序列短一点(NM_080911,注:拿这两个基因的序列ClustalW一下就可以了)。这里用UNG2的序列设计引物,选择RefSeqmRNAdatabase,物种是Human,其它默认。结果如下图A-B所示,设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图,把“AllowprimertoamplifymRNAsplicevariants”这个选项给勾上,出现的结果如下图-C所示,新的引物也可以扩增出UNG1(注:我试了一下,不能得到预期的结果,可能参数没设对)。Figure.Primer-BLASTresultsforUNGtranscriptvariant2.TheNCBIReferencesequenceNM_080911wasusedasatemplate.Toppanel:PrimersspecifictothesinglesplicevariantarereportedbydefaultwiththemRNARefSeqdatabaselimitedtohumansequences.Bottompanel:Primersthatamplifybothsplicevariantsarefoundwiththeoptiontoallowsplicevariants.四、一些Tips1,在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession号(尽量不要Fasta格式的序列)。另外,确保你的序列是最新版本的(在填AccessionNumber时后面不加版本号就会自动拿最新的序列)2,就算你对整个序列的某部分感兴趣(如某条染色体上的某个区域),你也应该优化使用Gi号或Accession号(Primer-BLAST有参数可以设置设计引物的范围,”Form-To”,如上面的第一幅图所示)。因为用Gi号或Accession号,NCBI会自动读取该序列的一些注释数据,对引物的设计更加有利。3,尽量使用没有冗除的数据库(如refseq_rna或genomedatabase),nr数据库包括了太多的冗除的序列,会干扰引物的设计。4,请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索,将会使程序变得很慢,引物的结果也会受其它不相关的物种影响。
本文标题:Primer-BLAST-NCBI-的引物设计和特异性检验工具
链接地址:https://www.777doc.com/doc-5212788 .html