体外培养的细胞生物学特点

生物学特点体外培养物的细胞生物学特点总的：与体内仍有相似--体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系但有不同相对孤立、相对单一失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显体外培养物的细胞生物学特点与体内仍有相似--体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系体外培养单个细胞也能生存和增殖但单个细胞不是细胞永久存在的形式,培养的细胞之间仍有在形态和机能上的相互依存关系1.培养的细胞之间仍有在形态和机能上的相互依存关系。在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止细胞相互沟通生物信息的结果2.培养的细胞和基质之间对细胞外基质仍有依存性但有不同人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同当细胞被置于体外培养后久了,必然发生变化与体内主要不同相对孤立、相对单一缺乏体内的一些影响主要表现失去原有组织结构和细胞形态如：肌肉细胞—纤维化分化减弱或不显出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化或获得不死性或变成具有恶性性状的细胞群因此要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体培养细胞的主要的生物学特点1.去分化2.贴壁和铺展3.接触抑制和密度依赖性去分化体外培养物的细胞生物学特点体外培养生长生物学特征具有两重性基本生物学特征仍与体内的细胞相似培养物在体外条件下生长，许多生长生物学行为发生改变培养细胞分化状态的变化体内细胞--三方面的影响与调节:体外环境的影响体内神经—体液因素的调节细胞与局部微环境的相互作用控制--维持着细胞的分化特征。体外培养时，失去了--分化特征逐渐减弱去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性如:培养的成纤维细胞在适当刺激下，可分化为其它结缔组织细胞和肌组织细胞，表现出类似未分化的间充质细胞的特性，‘返祖’有2点1.但,去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态如:高度分化的神经细胞和心肌细胞已经丧失的增生活性不可能恢复但已经具备的生物电活动特性不会完全失去2.可重新表现出分化特点如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞内皮细胞--但，这种能力会随着培养时间延长逐渐丧失总之，休外培养,使细胞结构与功能上的“可塑性”增大防止去分化贴附和铺展贴附(粘附)和附着粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的生长表面是细胞能否成功粘附的主要因素。不同细胞的粘附能力不同如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面粘附能力强的细胞---粘附能力弱的细胞---可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞细胞形态因是否贴附于底物而不同悬浮的细胞:基本圆形粘附和贴壁的细胞:扁平圆形相差显微镜“亮圈”很快过渡--贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着—伸展影响因素各种细胞不同如接种30’后…第二瓶30’…(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞——上皮细胞——血细胞(最弱)生物因素血清、培养液中的促附着因子机械，物理等其他因素因素离心：促进附着流动：培养液流动可阻止细胞附着低温：可抑制附着措施（因素）1.包被对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质如:--通过其所带电荷先吸附--,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分细胞本身也可能产生一些粘附分子措施2.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度如，培养液中的Ca含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁促进细胞粘附的成分铺展铺展（伸展）(spread)进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞极性细胞就是各种有机体细胞在体外的特征性细胞形态铺展状况是调节细胞形状的主要方面铺展得越好，细胞越扁意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展状况与细胞的生长有密切关系只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行通过比较贴壁依赖性细胞不同铺展程度与DNA合成率之间的关系发现细胞越扁(厚度越小)DNA合成率越高细胞形状(伸展)与细胞的生长合适的细胞形状-伸展对正常细胞的DNA合成重要对其生长重要伸展的意义实验一成纤维细胞1.附着于玻璃或塑料底物:细胞增殖2.悬浮培养:细胞不增殖3.a.培养在悬浮的玻璃纤维上:若够长:细胞可增殖若短于20um,细胞可附着,但增殖很慢或不增殖b.在某些塑料上:有些细胞可附着,但增殖很慢或不增殖伸展的意义原因分析在1.附着培养物上:细胞很扁平,很伸展在2.悬浮培养中:细胞圆球形,未伸展在3.培养中:细胞维持介于扁平与圆球之间因此,细胞形状,至关重要伸展至原来的形态,才能增殖伸展的意义-实验伸展的意义-实验二PolyHEMA35----------0.0035um高浓度（厚）低浓度（薄）细胞圆扁（附着最差）获得细胞构型（模型）不同伸展程度的细胞PolyHEMA细胞厚厚（21~22um）（伸展差）（10+-2）薄薄（2um）（伸展好）（46+-13）PolyHEMACellHeight(um)H3(C.P.M).1.00227+-54x10-21550+-54x10-36250+-15细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状当接触坚硬平面即铺展于底物上，扁平状与底物形成很多接触点伸展过程(1)开始阶段开始附着铺开细胞附着于底物球形的细胞，下方表面与底物接触成扁但尚未形成新的伪足伸展分几个阶段(2)放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起伪足形状主要柱形丝状:直径0.2-0.5um长10-20扁平片状:厚0.1-0.5宽2-5尚有:小泡状叶状:直径1-2开始时:絲状多以后片状增加许多伪足形成薄的胞质小片牢固贴于底物胞体中央部分扁整亇细胞扁平(3)极化阶段细胞最后伸展附着的情况实验：用多种细胞，以显微操作及缩时电影定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况检测--显微针头—结果：附着规律附着点：附着规律几乎未见于细胞的中央区(如不在核之下)总在边缘，边缘”摆动”活动的部位凸的边缘在薄的边缘附着区：约为细胞下面表面的15-35％附着、伸展的条件底物细胞能在很多固体表面附着最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上如Fn，胶原，聚赖氨酸机械，物理因素接触抑制和密度依赖性接触抑制和密度依赖性生长仰制运动的接触抑制密度依赖性生长仰制增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，5d细胞计数于加入10％、20％、30％牛血清的培养液中，结果：增殖的密度抑制结果：①10％血清：20hr后铺满(汇合confluent)以后至5d细胞数不再增加(细胞数约106／6cm皿)密度抑制30%血清：以后经常换液至5d，细胞密度继续增加(可达6xl06／6cm皿)说明:密度抑制---铺满后不再增殖(分裂停止)血清可降低密度抑制只加入于3T3停止生长的培养液中细胞不生长○当再加入血清细胞又生长说明血清可消除密度抑制(2)转化细胞的密度抑制降低①用此培养液3T3细胞不再分裂增殖②当再加入10％血清，3T3细胞可再增殖表示血清可消除密度抑制③但当用此培养液，于转化的3T3细胞(SV3T3)却生长良好表示转化细胞密度抑制降低(血清需要降低)说明：转化细胞的密度抑制降低.可生长至较高的密度总的说明：①细胞生长有密度抑制②血清可降低密度抑制③转化细胞可降低密度抑制