酶联免疫吸附实验讲义全解

2010年吕梁市兽医实验室培训酶联免疫吸附试验EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA吕梁市动物疫病预防控制中心刘裕田1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介1.1、基本概念：抗原、抗体、抗原抗体的特性1.2、ELISA方法简介：1.3、ELISA方法的原理1.4、ELISA方法的分类2、ELISA试剂的组成2.1、ELISA试剂盒的组成2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、参考标准品（定量测定）；2.1.5、酶标记物及样本的稀释液；2.1.6、洗涤液；2.1.7、酶反应终止液。3、ELISA实验过程3.1、试剂的准备3.2、加样3.3、保温3.4、洗涤3.5、显色和比色4、ELISA试验的质量控制4.1分析前质控4.1.1人员培训4.1.2仪器质控4.1.3标本采集及处理过程的质控4.2分析中质控2、ELISA试剂的组成2.1、ELISA试剂盒的组成2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、参考标准品（定量测定）；2.1.5、酶标记物及样本的稀释液；2.1.6、洗涤液；2.1.7、酶反应终止液。3、ELISA实验过程3.1、试剂的准备3.2、加样3.3、保温3.4、洗涤3.5、显色和比色4、ELISA试验的质量控制5、胶体金试纸5.1、免疫层析法简介及特点5.2、免疫层析法的结构及原理二、培训内容（操作部分）6、操作过程演示7、计算软件应用说明1、酶联免疫吸附反应法（ELISA）1.1、基本概念：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性1.2、ELISA方法简介ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和微生物检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA方法开发的用于病原微生物以及食品中抗生素检测的试剂盒产品。1.3、ELISA方法的原理基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。1.4、ELISA方法的分类直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a）间接性ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。间接性ELISA原理：显色夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。包被鸡抗NP蛋白IgGIBV加IBV或被检加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物显色加终止液双抗体夹心ELISA检测传染性支气管炎病毒（IBV）双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)洗板待测抗体底物温育显色酶标抗原EE洗板固相抗原EEEEEEE液相阻断ELISA用于检抗体，得到的结果比间接ELISA可靠。其过程如下：抗原包被酶标板，加待检血清，后加酶标抗体，底物显色，终止。如果待检样阳性则与酶标板上包被的抗原结合，阻断酶标抗体与其反应。结果OD越高，为阴性，低为阳性实验中用标准阴性和阳性血清阻断率来判断实验精确度，得到的结果有较好的线形关2、ELISA试剂的组成2.1、完整的ELISA试剂盒应包含以下：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。2.2.1、固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。2.2、免疫吸附剂：已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。2.3、酶标记物：即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。2.4、酶的底物2.4.1、HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+H2O2D+H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。2.5、洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。2.6酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。2.7参考标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。3、ELISA实验过程3.1试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或去离子水。自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。3.2加样在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。3.3保温在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。为了便于操作目前绝大部分的试剂盒均采用室温进行温育反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。3.4洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下：a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。3.5显色和比色3.5.1、显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。3.5.2比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。比色结果的表达以往通用光密度（opli