花粉生活力测定

实验五花粉生活力的测定一、实验目的学习和掌握花粉生活力测定的方法花粉二、实验原理作物杂交工作中，往往会遇到父母本花期不遇，必须采集花粉短暂贮藏，经贮藏的花粉及其生活力如何，必须经过测定，以保证杂交效果。此外，花粉的生理研究，作物雄性不育和远缘杂交都要鉴定花粉育性和生活力。正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力的高低直接影响植物授粉、受精乃至坐果。花粉生活力测定的方法较多，常用的有：形态鉴定、花粉发芽鉴定、染色鉴定。形态鉴定：花粉有无生活力在形态上有明显差异，即形态是否发育正常，其内部淀粉等内含物是否充实。发育不正常的花粉，内含物不充实而空秕，形状也不规则，大小参差不齐。而正常花粉内含物充实饱满，形状规则，大小整齐。因内部含有较多淀粉粒而遇1%I-IK溶液呈深紫色反应，遇水易吸涨而破裂。一般适用于不育系及远缘杂交后代花粉形态和育性的鉴定。★简便，但是一般用于要求不严格新采集的花粉花粉发芽鉴定：配制一定浓度的蔗糖溶液等作培养基，在人工控制条件下进行花粉发芽试验，根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力。也可以在授粉数小时后直接观察柱头花粉萌发伸长情况。染色鉴定：用不同的化学试剂如氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride、C12H15N4Cl，简称TTC或四唑）、联苯胺茶酚等快速鉴定花粉生活力。三、实验用品1、材料正在开花的植株花粉（百合）2、器具盖、载玻片凹式载玻片培养皿滴管镊子解剖针吸水纸水浴锅恒温箱天平烧杯玻棒电炉荧光显微镜普通显微镜3、药品蒸馏水硼酸蔗糖琼脂联苯胺α-奈酚碳酸钠过氧化氢磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化三苯基四氮丙酮二丙酸酯荧光素四、内容与方法（一）培养法：1、配置培养基取100ml蒸馏水中，加1~2g（即1%~2%）琼脂煮开，使之溶解，然后再加入一定量的蔗糖或葡萄糖和0.01g硼酸，制成不同浓度（5%、10%、15%、20%）的蔗糖琼脂培养基。2、制片用玻棒蘸少许培养基，趁热滴入凹形载玻片，放置片刻，待凝固后，撒上少许花粉粒。注意要均匀，不可过多，否则，在显微镜下，不易分清数目。3、培养将制好的玻片放于培养皿，下面垫有脱脂棉，加入少量水，以保持湿度。将培养皿盖好，置于20~25℃恒温箱中。4、镜检在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上），若发现花粉已发芽时，就随机地在显微镜下取5个视野，记录花粉粒总数和发芽数，算出平均值，将观察结果填入表内。花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。若花粉发芽率在5%以下，为极弱，不能采用。（花粉发芽率=发芽花粉总数\花粉总数*100）培养过程要密切观察，不可使花粉管萌发的太长，否则难以计数。★培养基法能够统计出百分率，准确度高，但是操作相对复杂，而且花粉发芽条件与实际不完全相符易受培养基配方的影响导致结果的偏差。配置培养基（100ml水+1g+琼脂+0.01g硼酸+5-20g糖）煮沸溶化用玻棒分装与凹玻片中播撒花粉置于培养皿中20-25℃恒温培养数小时保持湿度在显微镜下镜检计数【注意事项】1.不同种类植物的花粉萌发所需温度、蔗糖和硼酸浓度不同，应依植物种类而改变培养条件。2.此法也可用于观察花粉管在培养基上的生长速度以及不同蔗糖浓度，离体时间，环境条件等因素对花粉活力的影响。3.不是所有植物的花粉都能在此培养基上萌发，本法适用于易于萌发的(葫芦科等)植物花粉活力的测定。（二）联苯胺法：（染色法）具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活性。实验中甲液成分为联苯胺，α-萘酚、碳酸钠，乙液成分为过氧化氢。H2O2+酚醌+H2O过氧化氢酶（无色）（红色、玫瑰红色）1、配制药液a．0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液；b．0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液；c．0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用d.使用时将这三种溶液等量配成“甲液”，放入棕色滴瓶中备用，e.将过氧化氢用蒸馏水稀释成0.3%的溶液作为“甲液”，随配随用。2、观察取花粉少许撒入凹型载玻片，然后在花粉上滴“甲液”一滴，片刻后，再滴入“乙液”一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片。经3～5分钟后，再放在显微镜下检查。有生活力的花粉呈红色或玫瑰红色，不着色者为无生活力的花粉。为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。将适量花粉置于载玻片上先滴1滴甲液，再滴1滴乙液充分反应显微镜下镜检计数，红色的为有活力的花粉【注意事项】滴加甲液和乙液后，会产生大量的气泡，为了不影响观察，应待反应充分完毕后在加盖玻片观察，可以用镊子轻轻搅动，加速反应，待气泡基本消失后方可观察。统计生活力的方法同前。★染色法用时短，见效快，但颜色判断易受个人因素影响，导致结果有较大差别。（三）TTC法：（染色法）TTC即2、3、5-三苯基四唑氯化物。主要原理在于检验花粉呼吸过程中脱氢酶的活性。2、3、5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的氧化状是无色的，被氢还原时成红色的TTF。具有活力的花粉呼吸作用较强，由于呼吸作用产生的氢能使TTC还原成TTF，因此花粉便染成红色；而无生命的花粉没有呼吸代谢活力，TTC不被还原，因而不着色。所以，可根据花粉染不染成红色来判断有无生命力，从而测定花粉生活力。1、配制溶液（1）磷酸缓冲液：在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克的磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾,调整pH值为7.17。（2）TTC溶液：称取0.02~0.05克(不同植物所用的量是不同的)的TTC溶解在10ml的磷酸缓冲液中,溶液配好后装入棕色瓶内，置入暗处。【注意事项】因氯化三苯基四唑有毒，操作时要注意安全。2、操作步骤（1）取少量花粉放在载玻片上，并在花粉上滴上1~2滴配制液，用玻璃棒混合盖上盖玻片。（2）将载玻片置于恒温箱中（35~40℃）约15~20分钟。（3）在显微镜（10X10）下观察：凡具有生活力的花粉呈红色，部分丧失生活力的呈淡红色，无色的是死的和不育的花粉粒。3、观察和测定结果：每片观察3个视野，并统计具有生活力的花粉的百分率。（四）荧光法：1、溶液配制（1）50mg二丙酸酯荧光素溶于10ml丙酮中。（2）0.5M蔗糖溶液100ml.（3）取10ml0.5M蔗糖溶液，将5mg/ml二丙酸酯荧光素溶液逐滴加入蔗糖液中至饱和，为染液。2、操作步骤（1）滴1滴染液于载玻片上。（2）将供试花粉撒在染液中。（3）静置5分钟。（4）加盖片后于荧光显微镜下观察。（激发BG12）五、结果与分析1、将培养基法和染色法两种方法测得的结果列表记录，并计算花粉的生活力。2、比较测定花粉生活力三种方法的优缺点。3、绘制一花粉粒发芽形态图。形态鉴定（1）在载玻片上置少量正常的稻、麦或棉的新鲜花粉，于低倍显微镜下观察花粉形态。不同育性和生活力的花粉在形态上有明显差异。水稻和小麦不育花粉空秕畸形，可育花粉饱满球形；棉花不育花粉呈半圆形和棒状，大小也参差不齐，可育花粉均为圆形，大小整齐一致。（2）与形态观察相同，但在有花粉的载玻片上滴1滴1%I—IK，再观察花粉是否染色和染色深浅情况，以判断花粉内含物的充实度。正常花粉应有较多的淀粉粒，遇I—IK呈紫黑色，不正常的染色浅或不染色。对于新采集的花粉来说，还有一个更为简便的鉴定方法——形态鉴定法。将花粉用解剖针播于一般载玻片上，然后直接放到显微镜下观察，根据形态特征，判断花粉的生活力状况，一般来说，畸形、皱缩、小形化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。要根据各种植物花粉的特点，采取适当的保存方法。花粉生活力的测定方法很多，其中发芽试验手续较复杂，设备要求较高，需时也较长。为了简易而迅速的测定花粉生活力，也常采用化学染色的方法，但是此法也有缺点，就是染上色的花粉不一定都具有生活力，因为染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常发芽的花粉，所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽实验。要是要求不严格对新采集的花粉还有一个较简便的鉴定方法——形态鉴定法。本实验目的是学习花粉生活力测定的方法，进而研究花粉寿命长短与环境条件的关系，以探求保存花粉的合适方法。花粉发芽法人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。