SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白测定

王永军：经典测定方法集粹１植物组织中SOD、POD、CAT、MDA、APX和可溶性蛋白测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。或A液：0.2M的NaH2PO4溶液分析纯NaH2PO4•2H2O31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液分析纯Na2HPO4•12H2O71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000×g），上清液（酶液）倒入试管中，置于0～40C下保存待用。三、SOD的测定：1.SOD（超氧化物歧化酶）反应液的配制：母液的配制：（1）05M磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml；（2）130mMMet(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml(避光保存)；（4）100μMEDTA-Na2：取0.0372gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（5）20μMFD(核黄素)：0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml（现配现用）。SOD反应液：磷酸缓冲液MetNBTEDTA-Na2核黄素（FD）H2O的比例为1533332.5，按母液顺序配制。2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光（多用为环形日光灯的光照培养箱）30分钟（尽量做到照光情况一致），同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V／（W×0.5×ACK）单位：NBT光还原50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/可溶性蛋白质浓度四、POD（过氧化物酶）的测定：王永军：经典测定方法集粹２1.0.1MPH6.0磷酸缓冲液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至500毫升；2.POD反应液的配制：0.1MpH6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3.POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值（ΔA470/min·mgpr或ΔA470/mgFW）表示酶活力的大小。4.结果计算：POD活性（ΔA470/min·gFW）=ΔA470×V/Va/W=ΔA470×5/0.02/0.5=ΔA470×500五、CAT（过氧化氢酶）的测定：1.CAT反应液的配制：0.1MH2O2溶液：0.568毫升30%H2O2定容至100毫升。0.1MPH7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液，定容至500毫升。0.1M的H2O25毫升+0.1M的PH7.0的磷酸缓冲液20毫升（即按1：4的比例）混匀，即为CAT反应液。2.CAT的测定：0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240纳米下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。3.结果计算：CAT活性（Δ240/min·gFW）=Δ240×/0.05/0.5=Δ240×200=Δ240×V/Va/W六、MDA（丙二醛）的测定：1.MDA反应液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。3.MDA的测定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离心，取上清液，在600、532、450nm三个波长下比色。4.结果计算：MDA（μmol/gfw）=(6.45×(D532-D600)-0.56D450)×0.015/W或(6.45×(D532-D600)-0.56D450)×0.03/W七、可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。测定：20微升酶液+3毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白（20微升缓冲液+3毫升G-250）。结果计算：可溶性蛋白（mg/Gfw）=(C×V/Va)/W王永军：经典测定方法集粹３八、脯氨酸含量的测定试剂配制：0.6克磺基水杨酸，定容至200毫升：酸性茚三酮（现配）：3.75克茚三酮+90毫升冰醋酸+36毫升蒸馏水测定：0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸，加盖，沸水浴10分钟，过滤，吸取滤液2毫升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水）、2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静止分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，520纳米下比色。结果计算：脯氨酸含量（μg/g鲜重）=C×V/Va/W九、APX（ASA-POD）－抗坏血酸过氧化物酶测量：取材料0.5g,置研钵中，加入5ml4℃下预冷的提取液（同上）和少量石英沙研磨,在12000g·min-1下离心20min，上清液即为APX粗提液，4℃下保存备用。（如果是长期保存的材料，则提取液为0.186gEDTA,0.4718gASA,用pH7.0的缓冲液定容到500ml，此处作用是防止APX失活，但是新鲜材料则两提取方法对后来结果影响差异不明显）APX反应液：11.2L30%H2O2+0.04718gAsA（抗坏血酸－Vc），磷酸缓冲液(pH7.0)定容至500ml。（此反应液必须现配现用）0.1ml酶提取液+2.9mlAPX反应液,290nm比色（0-40s）。