武汉大学分析化学下册08

第8章分子发光分析法8.1概论8.1.1分子发光的类型按激发的模式分类：分子吸收光能被激发，所产生的发光为光致发光，如分子荧光和磷光。分子由化学反应的化学能或由生物体（经由体内的化学反应）释放出来的能量所激发，其发光分别称为化学发光或生物发光。以分子发光作为检测手段的分析方法称为分子发光分析法，本章所介绍的包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。8.1.2分子发光分析法的特点灵敏度高。较吸收光度法一般要高2~3个数量级。选择性比较高。物质对光的吸收具有普遍性，但吸光后并非都有发光现象。即便都有发光现象，但在吸收波长和发射波长方面不尽相同，这样就有可能通过调节激发波长和发射波长来达到选择性测定的目的。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。发光检测的高灵敏度，以及发光光谱、发光强度、发光寿命等各种发光特性对所研究体系的局部环境因素的敏感性，因此，发光分析法在光学分子传感器以及在生物医学、药学和环境科学等方面的应用更显示了它的优越性。8.2分子荧光与磷光光谱分析法8.1.1分子发光的类型按激发的模式分类：分子吸收光能被激发，所产生的发光为光致发光，如分子荧光和磷光。分子由化学反应的化学能或由生物体（经由体内的化学反应）释放出来的能量所激发，其发光分别称为化学发光或生物发光。以分子发光作为检测手段的分析方法称为分子发光分析法，本章所介绍的包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光分析法。8.2.1基本原理1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…；8.2分子荧光与磷光光谱分析法2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；3.激发态→基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为l‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l‘2l2l1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命：荧光分子处于S1激发态的平均寿命，可用下式表示：τf=1/（kf+ΣK）磷光寿命（τp）指的是磷光分子处于T1激发态的平均寿命，可由类似的公式表示。荧光量子产率：荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。由于激发态分子的衰变过程包含辐射跃迁和非辐射跃迁，故荧光量子产率可表示为ɸf=kf/(kf+ΣK)磷光的量子产率（ɸp）定义为：PPSTPjKKK8.2.1.2荧光、磷光与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：吸收的光量子数发射的光量子数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。8.2.1.3影响分子发光的环境因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；8.2.1.4荧光、磷光的猝灭1.猝灭发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂。2.动态猝灭与静态猝灭猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用引起动态猝灭；猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用引起静态猝灭。8.2.1.5激发光谱和发射光谱荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱8.2.1.6荧光(磷光)强度与溶液浓度的关系溶液的荧光强度(If)与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量子产率(Фf）有如下关系If=fIa由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可推导出，当bc≤0.05时，有：If=2.303fI0bc与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷光物质浓度之间的关系可表示如下：IP=2.303STPI0bc随着溶液浓度的进一步增大，将会出现发光强度不仅不随溶液浓度线性增大、甚至出现随浓度的增大而下降的浓度效应。发光的再吸：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；8.2.2荧光、磷光分析仪器8.2.2.1荧光分析仪器测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。仪器光路图仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；8.2.2.2磷光分析仪器荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。8.2.3荧光的常规测定方法1.直接测定法要求被分析物本身具有荧光。通常采用相对测量方法，如工作曲线法。每次测绘工作曲线最好用同一种稳定的荧光物质校准仪器的读数。2.间接测定法被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等8.2.4磷光测定的方法1.低温磷光分析由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制备和提纯。8.2.4磷光测定的方法2.室温磷光分析固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。胶束稳定的室温磷光分析：磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。敏化室温磷光分析8.2.5荧光、磷光分析法的应用荧光特性对于微环境的敏感性，荧光分析法已广泛作为一种表征技术，用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。目前，可以采用有机试剂以进行荧光分析的元素已近70种。磷光具有Stokes位移大的优点，室温磷光分析法得到不断的发展，已成为一种与荧光分析法相互补充的重要分析技术，在生物医学、药物分析、临床检验、农药和植物生长激素的分析以及环境中多环芳烃的检测等方面得到了日益广泛的应用。8.3化学发光分析法8.3.1概论化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发光。基于这类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析法。优点：(1).灵敏度很高。(2).仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3).线性范围宽；(4).分析速度快。局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。8.3.2基本原理在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。化学发光效率化学效率：emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数参加反应分子数激发态分子数ce发光效率：激发态分子数产生光子数em时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：tctIddclcldc/dt分析物参加反应的速率；3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：cttcttIAttcl0cl0cldddddc/dt=Kc；K为反