结构生物学(电镜,核磁共振,X射线衍射,质谱)

生物大分子要发挥功能，必须满足两个条件:²第一，凡要发挥功能和活性的生物大分子必须具有特定的，自身特有，相对稳定的三级结构;²第二，结构运动。任何的破坏促使没有稳定的三级结构和结构运动，生物大分子是很难发挥生物功能或活性的。结构生物学是通过确定生物大分子三级结构，来研究生物大分子的结构功能关系，从而探讨生物大分子的作用机制和原理作为研究目的。主要研究方法:²X-射线晶体衍射方法（X-射线蛋白质晶体学）²多维核磁共振（NMR）²电镜晶体学和电镜三维重组方法²60年代当时的开文迪许实验室的M.PerutzJ.Kendrew用X-射线晶体衍射技术获得了球蛋白的结构.由于X射线晶体衍射技术的应用，使我们可以在晶体水平研究大分子的结构，在分子原子基础上解释了大分子.²由于他们开创性的工作，Waston,Crick获得了1962年的诺贝尔生理学与医学奖,M.Perutz和J.Kendrew获得了同年的化学奖.²从那时起，技术的发展就成为结构生物学发展最重要的决定因素。起源：1950s,Waston,Crick发现了DNA双螺旋结构，建立DNA的双螺旋模型。²60-70年代，在同一实验室的他们又发展了电子晶体学技术，当时的研究对象主要是有序的，对称性高的生物体系，如二维的晶体和对称性很高的三维晶体。²70-80年代，多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶液中研究生物大分子成为可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理状态.²80年代到本世纪初，冷冻电子显微镜的发明，这种技术的发明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状态和溶液状态的结构，而且能够研究研究复杂的大分子体系超分子体系，这就是细胞器和细胞.可见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到大分子体系，超分子体系，如核糖体(ribosome)、病毒、溶酶体(lysosome)和线粒体等.²发生和发展：H.W.布拉格和W.L.布拉格父子于1912年提出和发展起来的。最先用于无机晶体分析,1953年,沃森和克里克用于DNA晶体分析,至60年代,肯德鲁和佩鲁兹用于研究血红蛋白和肌红蛋白,逐渐成为生物大分子晶体结构研究的重要手段,直至今天仍占据统治地位。²优点：分辨率高,达到原子分辨率,既可研究水溶性蛋白、也可研究膜蛋白和大分子组装体与复合体.它能给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构,从分子水平理解蛋白质如何识别和结合客体分子,如何催化,如何折叠和进化等生命的基本过程,进而阐明生命现象.如1997年底,应用X射线单晶衍射方法完成了有关核小体(nucleosome)的核心颗粒分辨率为0128nm的精细空间结构的测定,每个核小体的盘状核心含有8个组蛋白形成的八面体、外绕146个碱基对组成的DNA,这一杰出的成就对了解基因转录、DNA复制与修复的动态过程都很重要.此外,应用X射线单晶衍射技术测定蛋白质和核酸的晶体结构并结合分子模拟技术,已经为新药物的设计提供了一个全新的方向,大大缩短了新药的研制过程.新药的设计和开发,要求对这些药物靶标(drugtarget)的结构、性能有精确的了解,由于迄今对其了解甚少,现有临床药物绝大多数是通过尝试筛选获得的,导致研制一个新药常常需十多年,甚至几十年的时间.通过对爱滋病病毒(HIV)蛋白酶的精细结构测定,并以此为靶标设计酶的抑制剂作为治疗爱滋病的有效药物获得巨大成功,已显著减少爱滋病死亡数量.XX--rayray测定生物大分子结构的原理测定生物大分子结构的原理Questions?•为什么要用X-射线?•为什么要用衍射?•什么是晶体，为什么要用蛋白质晶体进行衍射?•如何根据衍射结果解析蛋白质结构?X-rayProteinCrystalX射线是波长在100Å～0.01Å之间的一种电磁辐射,常用X射线波长约在2.5Å～0.5Å之间，与原子以及化学键的尺度相当，都在Å的数量级。因此可以被用来探测蛋白质分子内部的结构。为什么要用衍射把光源换成X射线把透镜换成X射线透镜到目前为止人类还没有发现什么方法能够让X-射线发生折射。所以当前只能通过衍射这种不那么直观的方法来研究蛋白质分子内部构造。什么是晶体？晶体在宏观上呈现出规则的几何形状NaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaCl二维排列三维堆积晶体是一种具有长程、三维分子有序的固体“Acrystalishomogenoussolidexhibitingahighdegreeofinternalorderandadefinitealthoughnotnecessarilystoichiometricoverallchemicalcomposition.”²基本方程³劳厄定律³布拉格定律)]()(2cos[|)(|1)(hkllzkyhxhklFVxyzhklapr-++=∑+∞-∞=参考f(x)=Acos(2px–a))]hkl(i)lzkyhxi(2exp[|)hkl(F|V1)xyz(hkl∑∑∑α+++π-=ρ上式也可表示为：vρ为电子密度，xyz为实空间坐标vV为晶胞体积v|F(hkl)|2=I(hkl)，I代表衍射点的强度，hkl为衍射点坐标vα代表初始相角hk00对于一束X-射线f(x)=Acos(2px–a)来说，无论它的初始相角是多少，它在接收屏上所形成的曝光点都是相同的。反之，我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得知造成该曝光点的X-射线的初始相角信息的。初始相角无法直接测量得到，但它又是求解电子密度时所必需的信息。这就是X-射线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题——相位（相角）问题。解决相位问题的方法：1.同晶置换法（MIR）：最原始的方法，包括多对同晶置换法和单对同晶置换法。需要在蛋白质晶体中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同。解析过程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据。2.反常散射法（AD）：包括多波长反常散射法（MAD）和单波长反常散射法（SAD）。通常需要引入具有较强反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X-射线照射下的多套衍射数据。随着技术的进步，目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源。3.分子置换法（MR）：需要同源性较高的蛋白质分子结构模型，不需要多颗晶体，不需要多套衍射数据，方便快捷，但不能用来解析全新的结构。4.直接法（Directmethod）。这是未来的方法，对蛋白质来说仍处在向实际应用的发展阶段。主要技术流程图蛋白质结晶的必要条件v蛋白质分子必须均一（纯化）均一的蛋白质分子不均一（不纯）的蛋白质分子沉淀剂的作用沉淀未饱和成核区过饱和区蛋白质浓度沉淀剂浓度获得蛋白质晶体的方法由于蛋白质分子体积大，分子表面情况复杂，极性不明显，分子间作用力弱等原因，蛋白质分子在达到过饱和的时候不容易有序排列形成晶体，而是容易随机聚合形成沉淀。因此需要针对不同蛋白质筛选各自的结晶条件。蛋白质结晶技术：v整批结晶法v液液扩散法v透析法v气相扩散法a.悬滴法b.座滴法悬滴法1ml蛋白溶液1ml结晶溶液结晶溶液池座滴法1ml蛋白溶液1ml结晶溶液结晶溶液池无论是悬滴法还是座滴法，当达到蒸汽平衡的时候，蛋白质所在液滴里的结晶溶液组分的浓度将会接近于池液的浓度。结晶溶液结晶溶液成分：v沉淀剂通常为不同分子量的聚乙二醇或者高浓度的硫酸铵、氯化钠等。v辅助分子通常为低浓度的盐vpH缓冲剂例如：HamptonResearchCrystalScreenKit#140.2MCaCl20.1MHEPESpH7.528%(v/v)PEG400Detergentsandadditives结晶条件的优化最初筛选得到的结晶条件往往不是该蛋白的最佳结晶条件。此时的蛋白质晶体往往衍射能力很差，甚至没有衍射。因此一般来说还需要对该蛋白质的结晶条件进行优化。优化的方法就是把结晶溶液中的沉淀剂、辅助分子，结晶时的蛋白质浓度在原浓度附近做一个梯度；相应地，结晶溶液中的pH值也要在原值附近做一个梯度。在把这些梯度排列组合起来，从而找出一个最佳的结晶条件。优化前优化后衍射实例²X射线衍射数据的收集质量对于结构的解析至关重要。²一套高质量的数据往往会使随后的结构解析工作达到事半功倍的效果。²由于蛋白质晶体内部含有大量的溶剂，热损伤和辐射损伤的影响，室温时蛋白质分子非常容易失去其三维结构。而且辐射损伤使数据收集受到干扰，使得测量产生实验误差。²早些时候，收集一套完整的数据需要几颗甚至十几颗晶体才能完成，这需要数据套之间的良好整合，为结构解析带来了非常不利的影响。²快速冷却至低温（flash-cooling）收据数据的方法解决了这个问题，同时这一技术也使捕捉存在时间很短的中间态成为可能。²选择合适的晶体：高质量的晶体，小晶体比大晶体的冷却效果好，光滑的比粗糙的好，重要的是没有裂缝²防冻液的选择²溶剂交换具体操作：1、使用晶体前，需要测试防冻液以确定玻璃化状态的最小的浓度。先用一个mountingassembly（loop的尺寸要与晶体大小匹配），在母液中蘸一下后迅速放在有低温氮气流的X-射线衍射仪的测角头上，在显微镜或屏幕上进行观察，如果液滴变为不透明（乳白色），则说明单纯的母液不能在低温冷却时使用，需要使用防冻剂。2、选择不同的防冻液和浓度直到被冷冻的溶液仍然澄清，则这个浓度的防冻液就是你所需要的低温冷却条件。随后便可以用晶体进行测试了。选择一颗合适的晶体，在所确定的防冻液中蘸一下迅速放在有低温氮气流的X-射线衍射仪的测角头上，测试其衍射情况。由于晶体会与单纯的母液对低温冷却的反应不同，因此还需要进行一系列的测试，以找到合适的条件，以使晶体在低温氮气中仍为透明的颜色。3、还可采用系列浸泡，透析和交联等等方法得到衍射较好，且镶嵌度小的晶体用于数据的收集。²同步辐射的原理和装置接近光速运动的荷电粒子在磁场中改变运动方向时放出的电磁辐射。它是1947年在GE公司的Schenectady实验室里发现的，当时它被认为是一种妨碍得到高能量粒子的“祸害”。1965年发明了储存环，它由一系列二极磁铁（使电子作圆周轨道运动）、四极磁铁（使电子束聚焦）、直线节和补充能量的高频腔组成，可以把电子束（或正电子束）储存在环内长时期运行，于是在每一个弯转磁铁处都会产生同步辐射，同步辐射才开始走向实用。²细胞膜通道的研究³JiangY，etal.Crystalstructureandmechanismofacalcium-gatpotassiumchannel1Nature2002,417(6888):515～522³JiangY,etal.Theopenporeconformationofpotassiumchannels1Nature,2002,417(6888):523～526²光合作用机制的研究³DeisenhoferJ,etalStructureoftheproteinsubunitsinthephotosynthetiereactioncentreofrhodopseu2domonasviridisat3Åresolution1Nature,1985,318:618～624³ZhenfengLiu,etalCrystalstructureofspinachmajorlight-harvestingcomplexat2.72Åresolution.Nature,2004,428(6980):287