脂肽抗生素的研究概况

6脂肽抗生素的研究概况脂肽（Lipopeptide）又名脂酰肽（Acylpeptide），是一类重要的抗菌肽，主要来源于一些由细菌、酵母菌、真菌分泌的代谢产物，其种类繁多、结构复杂，是一类由脂肪链和肽链组成的具有两亲结构的微生物次级代谢产物（Kosaric，1987）。脂肽一般来源于植物、动物和微生物，但大多数脂肽来源于微生物，而其中又以来源于细菌的脂肽居多。在细菌中，脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。1968年，Arima等首次从枯草芽孢杆菌株发现脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）（Arima，1968）。目前发现的抗菌脂肽主要有表面活性素（surfactin）、芬荠素（Fengycin）、伊枯草菌素（iturin）、和杆菌霉素（Bacillomycin），抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、制磷脂菌素（plipstatin）等。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性（Stein，2005）。脂肽在环境治理，医药、微生物采油等领域有重要的应用前景（Jitemdra，1997；Banat，2003）。6.1脂肽抗生素的种类及结构特性芽孢杆菌产生的抗菌脂脂肽的分子结构由脂肪酸链和肽链两部分组成，分子中的多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，β-羟基或者氨基脂肪酸的烃链形成亲油基，即是具两亲性的生物表面活性剂。其中亲水的氨基酸通过肽键相互连接，再与脂肪烃链上的羧基和β-羟基或者氨基结合形成环状，因此，抗菌脂肽一般是以内脂或者酰胺键结合而成的环脂肽（刘向阳，2005；吕应年，2005；Wang，2004）。芽孢杆菌脂肽抗生素主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin），芬荠素（Fengycin）三大类。6.1.1表面活性素（Surfactin）Surfactin类群的脂肪酸的碳链长度在13~16个，具有LLDLLDL的手性七肽通过一内酯键与脂肪酸链碳原子的β-羟基基相连，其在水溶液中分子成“马鞍状”构像，该家族成员包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（Surfactin），地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素（Llichenyishin），短小芽孢杆菌的表面活性剂（Pumilacidin）、埃斯波素（Esperin），其中Liehenyishin、Pumilacidin、Esperin主要应用于工业和环境治理（Meijietal.，1969.；Yakimoetal.，1995；Naruseetal.，1990）。而Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的β-羟基缩合形成环状结构（如图1-1）。Surfactin主要存在两种类型，即7位上的氨基酸是Leu和Val。肽链中典型的氨基酸组成顺序为(L-)Glu-(L-)Leu-(D-)Leu-(L-)Val-(L-)Asp-(D-)Leu-(L-)Leu（Kowalletal.，1998；杨世忠等，2004）。但是由于其2位（Leu/Ile/Val）、4位（Val/Leu/Ile/Ala）、7位（Leu/Val/Ile）氨基酸的不同及脂肪酸链长短（C13~C15）的不同其类似物也较多（刘向阳等，2005）。1991年Baumgart用二维H-NMR证明BacillussubtilisATCC21332和BacillussubtilisOKB105培养液中提取的Surfactin具有三种结构类似物（Baumgartetal.，1991），分别命名为SurfactinA、SurfactinB、SurfactinC、其中surfaetinA是主要成分，它的环状肽链上第七个氨基酸为Leu，SurfactinB的七位氨基酸为Val，SurfactinC的七位氨基酸为Ile。1992年Oka等采用优化后的高效液相色谱（HPLC），首次对枯草芽孢杆菌产生的六种表面活性素分离成功，并发现了两种具有不同脂肪酸取代物的新表面活性素。1995年俄罗斯科学家研究从发酵液中得到5个Surfactin的结构类似物，通过质谱技术、化学修饰和二维核磁共振技术确定了它们的结构。随后的研究更精确地测定了十余种Surfactin的同系物（Kowalletal.，1998），如表1-1（Vateretal.，2002）。Surfactin表现出抗病毒、抗肿瘤和支原体以及一定程度的抗细菌活性，它本身并不具备抗真菌活性，但可增强其它脂肽特别是伊枯草菌素的抗真菌活性（Kimetal.，2004）。图1-1Surfactin的结构示意图Fig.1-1Structureofsurfactin表l-1surfactin同系物的种类Table1-1Sortsofsurfactinisoforms6.1.2芬荠素（Fengycin）Fengycins类群包括芬荠素（Fengycin）和制磷脂素（plipastatinAl、A2、B1、B2）脂肪酸链碳链长度一般在14~18个，8个氨基酸成环，线状部分包括2个氨基酸和脂肪酸链（Nongnuchetal.，1986）。肽链中氨基酸组成顺序为(L-)Glu-(D-)Orn-(L-)Tyr-(D-)Thr-(L-)Glu-(D-)Ala（Val)-(L-)pro-(L-)Gln-(D-)Tyr-(L-)Ile，肽链的第10位Ile上的羧基和第3位的Tyr上羟基缩合形成环状结构（Vanittanakometal.，1986；Ongena，2005；Sehneider，1999），如图1-2。Fengycin能够抑制丝状真菌生长，对酵母和细菌无作用（Vanittanakometal.，1986）。它和Surfactin一样有许多同系物，往往同时共存于发酵液中。它们被分成FengycinA和FengycinB两种类型，当肽链的6位上是Ala时，属于fengyeinA；而当肽链的6位上是Val时，属于FengyeinB（WangJ，2004；StellerS，1999；Deleu，2005）。2008年Das还发现了苏云金芽孢杆菌cMB26（B.thuringiensisCMB26）产生的结构类似于Fengycin的脂肽抗生素（Kimetal.，2004）。常见的fengycin同系物如表1-2（Stinson，2003；高学文，2003）。图1-2FengycinA的结构示意图Fig.1-2StructureofFengycinA表l-2Fengycin同系物的种类Table1-2Sortsoffengycinisoforms6.1.3伊枯草菌素（Iturin）Iturin家族包括伊枯草菌素（Iturin）A、B，杆菌抗霉素（Bacillomycin）D、F、L，抗霉枯草菌素（Mycosubtilin）以及杆菌肽素（Bacillopeptin）A、B、C（陈华等，2008；Franeoiseetal.，1984；Aichaetal.，1982；Yoshioetal.，1995），其脂肪酸链碳链长度一般在14~17个，具有LDDLLDL手性7个强极性氨基酸短肽的N端氨基通过形成肽键脂肪酸链羧基相连（图1-3）。其中最有代表性的IturinA是由一个含有C14~C17的β-氨基脂肪酸和7个氨基酸残基的环状结构组成，7位上的Ser的羧基基和β-氨基脂肪酸的氨基缩合形成环状结构（Hiradateetal.，2002；Bessonetal.，1978）。伊枯草菌素具有较强的抗真菌活性（Bessonetal.，1978），也有部分抑制细菌的作用。Iturin的种类及其分子量见表l-3。Iturin能强烈抑制植物病原真菌还有部分细菌甚至还有杀虫作用。图1-3Iturin的结构示意图Fig.1-3StructureofIturin表l-3Iturin同系物的种类Table1-3SortsofIturinisoforms6.2脂肽抗生素的合成机理Lipmann在20世纪70年代首次开展了对肽生物合成的非核糖体机制分析，随后越来越多抗菌脂肽合成的相关基因被克隆、分析，结合全基因组测序的开展，获得了大量脂肽抗生素合成和调控的遗传信息（chenetal.，2009）。总之，芽孢杆菌的脂肽类抗生素的合成受一个由合成基因、调控基因共同组成大的基因簇控制，这些基因簇含有一个或多个转录单元，并且他们的表达是协同调控的，相似主链结构的脂肽抗生素产物是由相似的合成基因合成的。酶的活性或者存在于一个大的功能蛋白的不同结构域中，或者组织于一个多酶复合体中，脂肽抗生素的合成相关基因见表1-4。与核糖体合成的蛋白不同，非核糖体合成的脂肽抗生素的生物合成不以mRNA作为模板，也不需要携带工具tRNA，而是由多个肽合成酶组成的巨大复合物NRPS（non-ribosomalpeptidesynthetases），通过一种称为“多载体硫模板机制（MultipleCarrierThiotemplateMechani-sm）”的方式来合成的（Mohamed，1997；Sasehaetal.，2001）。NRPS是目前已知分子量最大的酶，它的运作是不依赖于核酸模板的非核糖体机制，它们在一种模板的指导下，能够识别特定的氨基酸并将其直接连接形成多肽链。每个肽合成酶都有一个或几个模块（module），每个模块都是一个独立的功能单元，大约由1000个氨基酸残基组成，负责将特定的氨基酸掺入肽链中。肽合成酶的模块排列顺序决定了产物中氨基酸的排列顺序，因此肽合成酶既是肽链合成的催化剂，也是肽链合成的模板。每一块模板负责一个反应循环，主要包括识别选择性底物并将其活化为相应的腺苷酸化合物，固定共价中间物和形成肽键。每一块模板在结构上又可以分为3个结构域：腺苷酸化结构域A、疏基化结构域T和缩合结构域C。腺苷酸化结构A域负责识别特定底物并通过ATP对底物进行活化；疏基化结构域T也被称为肽酰基载体蛋白（PCP），它负责固定反应中间物硫酯；缩合结构域C可以催化第一个模块的氨基酸脱离其载体，进而与第二个模块上的氨基酸形成肽键，如此新合成的肽链便向前移动了一个模块，不断延伸直到形成脂肽化合物。芽孢杆菌以不同的模块为模板，结构域有机结合发挥作用，形成多种多样的非核糖体肽。表1-4脂肽抗生素合成相关基因Tablel-5Lipopeptidessynthesase-relatedgenes6.3脂肽抗生素的应用抗菌肽的应用研究主要集中在农业生物防治、食品工业、畜牧生产业、医药行业、环境保护等领域。农业生物防治主要是是指脂肽应用于植物病原菌的生物防治（高芬等，2003；Vollenbroich，1997）。这是由于脂肽抗生素具有广谱的抗霉菌作用和一定的抗细菌作用，而其抗菌机理又不同于一般的抗生素，它可以使微生物的细胞膜上形成孔洞而使细胞内容物流出而死亡或鳌合一、二价阳离子从而抑制了多种酶类活性，不易产生耐药性（Steller，1999；Deleu，2005）。此外，肽类物质在自然界中易分解，属于环境友好类制剂，所以，在医药、植物病原菌的控制等方面具有广阔的应用前景。一些学者已经将抗菌脂肽的研究应用于植物病原真菌的抑制。黄现青研究了枯草芽孢杆菌fmbJ产生的脂肽对点青霉AS3.4356的抑制活性，测定了其抗菌谱，并进行了桃防腐试验。桃防腐试验表明其防腐效率可以达到76.5%，具有良好的桃防腐应用前景。Yu等将Bacillusamyloliquefaciens产生的iturinA用来防治西红柿的丝核病菌（Yuetal.，2002）。在食品行业中的应用主要是把脂肽作为食品防腐剂，并对此进行了大量的应用研究。食品安全和动物食品安全有赖于生产过程的各个环节，解决问题的一个关键就是使用无污染、无残留、无毒副作用的食品添加剂。抗菌脂肽是小分子短肽，参与生命过程，具有安全无毒副作用的生物学特性（Zaslo