蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nmG595250max该方法灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变的变化很大。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。【实验准备】一、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。（2）生理盐水：0.9%NaCl溶液。（3）标准蛋白质溶液：牛血清蛋白（BSA），用0.9%NaCl稀释成0.1mg/ml蛋白标准溶液。二、器材：试管和试管架、紫外分光光度计、移液枪、漩涡振荡器【实验步骤】一、制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂编号0123456标准蛋白质溶液/ml00.10.20.40.60.81.0生理盐水/ml10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂/ml5555555各管加入试剂立即置于漩涡振荡器上混匀后，静置5min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A595值），如下表所示。编号蛋白浓度（ug/mL）吸光度（A595）1100.1522200.1993400.3324600.4575800.57161000.667以吸光度（A595值）为纵坐标，标准蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，进行直线拟合，得到标准曲线，如y=0.0059X+0.093，R2=0.9975（注：一般相关系数应在0.995以上，至少2个9以上）。考马斯亮蓝标曲y=0.0059x+0.093R2=0.9975y=0.0059x+0.093R2=0.997500.10.20.30.40.50.60.70.8020406080100120浓度（μg/mL）A595A595线性(A595)线性(A595)二、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照标准曲线操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线对应回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.2-0.8之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。【注意事项】：1、玻璃仪器要洗净且干燥，确保无蛋白质、SDS、Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA及微量的去污剂如TritonX-100等污染或干扰实验结果。2、测定完后用乙醇将玻璃比色皿清洗干净。3、所测样品的A595nm值应在0.2-0.8之间，否则需要稀释后检测。4、必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。5、每次配制考马斯亮蓝染色液后都需要制作标准曲线。