蛋白质研究技术平台

蛋白质研究技术平台梁洁开放实验室2008.6.19蛋白质相关技术蛋白质样品的制备蛋白质浓度的测定蛋白质免疫印迹（westernblot)蛋白质相互作用研究蛋白质样品制备单层贴壁细胞总蛋白的提取：(1)收集细胞（1*106以上）(2)加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液(3)冰上裂解(4)4℃下12000rpm离心5min,取上清，-20℃保存组织中总蛋白的提取(1)取组织块（约0.1g)剪碎,加液氮磨碎、匀浆、超声处理(2)4℃下12000rpm离心15min,取上清，-20℃保存(3)膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要超滤(4)组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性蛋白质样品制备试剂RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS蛋白酶抑制剂：1mMPMSF,Aprotinin1μg/ml,Leupeptin5μg/ml,pepestatin1μg/ml,AEBSF50μg/ml,Bestatin10μg/ml,E-641μg/mlPMSF储存液：溶于异丙醇1.74mg/ml(10mmol/L)或17.4mg/ml(100mmol/L),分装后保存于-20℃，使用时稀释至1mmol/L，现用现加。产品名称Western及IP裂解液RIPA裂解液（强）)RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NP-40裂解液SDS裂解液产品价格138.00元168.00元168.00元168.00元168.00元168.00元有效裂解成分1%TritonX-1001%TritonX-100,1%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.5%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.25%deoxycholate1%NP-401%SDS裂解强度温和强中温和温和强对膜蛋白的裂解一般很好较好一般一般很好对胞浆蛋白的裂解很好很好很好很好很好很好对核蛋白的裂解较好很好较好较好较好很好胞浆磷酸化蛋白检测很好很好很好很好很好很好细胞核转录因子检测很好很好很好很好很好很好含蛋白酶抑制剂是是是是是是含磷酸酯酶抑制剂是是是是是是各种细胞裂解液比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明紫外吸收法较为灵敏50～100mg，比色杯的最小测量体积为0.1ml快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高～5mg慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度更高1～5mg,最小测量体积0.1ml快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS较好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性BCA法灵敏度非常高20～200mg,微量BCA为0.5～10mg较快速,40分钟内在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+螯合剂；略高浓度的还原剂抗干扰能力强，蛋白不可逆的变性蛋白质测定方法比较蛋白质浓度测定Bradford法测定蛋白质浓度试剂G250考马斯亮蓝溶液：0.15mol/LNaCl：1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准曲线0μg2.5μg5.0μg10.0μ20.0μg40.0μg1mg/mlBSA2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/LNaCl100μl97.5μl95.0μl95.0μl80.0μl60.0μlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1mlR2=0.999Bradford蛋白浓度测定试剂盒1.完全溶解蛋白标准品，取10ml稀释至100ml，使终浓度为0.5mg/ml。可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。2.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20微升。3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升。4.各孔加入200微升G250染色液，室温放置3-5分钟。5.用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。6.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。蛋白质核酸测定仪蛋白质免疫印迹(WB)原理protein蛋白质免疫印迹（WB)过程Figure1.SDS-PAGE蛋白质免疫印迹（WB)过程Figure2.WesternBlotSDS-PAGE所需仪器蛋白质电泳仪SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%)线性分离范围（kDa)1510-431212-601020-807.536-94配胶所需材料试剂10％分离胶（10ml）4％浓缩胶（5ml）超纯水4ml3.6ml30％Acr/Bic（29：1）3.33ml0.66ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－0.63ml10％SDS100ml50ml10%AP（过硫酸胺）100ml50mlTEMED5ml5ml蛋白质转印槽半干转印槽浸渍转印槽半干法转移槽使用说明膜滤纸胶滤纸正极负极Westernblot所需材料还原型5×SDS上样缓冲液5×电泳液缓冲液浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液TBST或PBST缓冲液封闭液（抗体稀释液）洗脱抗体缓冲液化学发光试剂（ECL）显影液和定影液抗体MarkWesternblot操作流程配胶：根据蛋白质分子量配制相应浓度的SDS-PAGE电泳：以5－100µg蛋白量上样，电泳至溴酚兰跑到底部。转印：剪下适当大小的PVDF膜，把胶铺在负极滤纸上，上面小心覆盖泡好的PVDF膜，夹好后倒入电转缓冲液，加入冰格，100V转移1小时。封闭：膜加封闭液（5％脱脂牛奶inTBS-T）,室温1h.抗体孵育：加一抗（1：1000）4℃孵育过夜，TBST洗三次，3x10min；加二抗（1：20000）室温1h，TBS-T洗三次，3x10min；显影：膜上加同体积ECLA，B液（100µl/cm2),依照荧光强度而定曝光时间，显影1、5、15min,定影10min.保存：X-胶片干后，将分子量和加样顺序标记上，把日期，抗体名称，孵育时间写上。把膜保存在－20℃以备以后使用。纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、APS剂量不足或失效；凝胶太快：TEMED、APS用量过多，胶太硬易裂SDS-PAGE常见问题Westernblot常见问题1、技术问题（1）电泳（2）转膜2、抗体问题（特异性、浓度）3、蛋白质丰度4、荧光淬灭（蛋白量过大）1、背景过深2、抗体特异性3、洗膜时间Westernblot常见问题Westernblot常见问题1、加样量2、ECL试剂3、曝光时间Westernblot常见问题1、蛋白质降解2、蛋白质分子量内参Westernblot常见问题4#：加样量过多Westernblot常见问题免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。在做WesternBlot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。Westernblot常见问题不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。Westernblot常见问题蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。Westernblot常见问题怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直?影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。Westernblot常见问题Westernblot结果如何分析目的蛋白110kd