SDS-PAGE及Western-Blot简明操作指南

SDS-PAGE及WesternBlot简明操作指南一．蛋白样品制备✓推荐使用RIPA裂解液。一般使用强裂解液，对于coIP可用弱裂解液。1.准备工作：1)取足量裂解液，加入PMSF和（或）蛋白酶抑制剂；若要检测蛋白磷酸化，推荐加入磷酸酶抑制剂。置于冰上预冷。2)准备足量PBS，置于冰上预冷。3)提前打开离心机预冷至4度。2.裂解样品：（注意保持样品处于冰上，4度离心）1)动物组织：取1g左右置入离心管，加入配制好的裂解液0.5-1ml，置于冰上，用匀浆器充分匀浆；2)悬浮细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；300g离心10分钟，去除培养基，收集细胞；1ml预冷的PBS重悬后，转移到1.5ml离心管中，300g离心10分钟，去除上清；加入60-200ul裂解液重悬细胞，置于冰上，裂解5-10分钟；裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。3)贴壁细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；去除培养基，用1mlPBS洗涤细胞；去除PBS，加入60-200ul裂解液，置于冰上，裂解2-3分钟；用细胞铲刮掉细胞，用移液器转移到1.5ml离心管中；置于冰上，裂解5-10分钟，裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。3.收集蛋白：1)将上述裂解样品于4度10000g离心10-20分钟，转移上清至一新的离心管，此即为蛋白样品。此处样品可于-20或-80度长期保存。4.蛋白的相对定量：BCA法✓为保证各样品western上样蛋白量一致，须定量蛋白；推荐相对定量；绝对定量需要在本方法基础上额外做BSA标准曲线。✓备注：每个蛋白要做2个重复，blank对照须使用步骤2中的裂解液。1)参考说明书，配制足量BCA工作液（多配制10%，以免不足）；2)取一96孔酶标板，在要用到的孔中加入上述BCA工作液，每孔100ul;3)在上述孔中分别加入1-2ul各蛋白样品及blank对照；4)将酶标板于37度孵育10-30分钟，直到出现较明显颜色变化即可；5)测定吸光度；6)计算相对蛋白含量：各吸光度去除blank背景，以吸光度最低者为参考，进行归一化处理，即计算吸光度倍数关系；western上样时，须依据此倍数关系调整各样品上样体积，以保证各样品上样蛋白量一致。5.western用蛋白样品的制备：1)向步骤3中的蛋白样品中，按1：4体积比例，加入5XSDS-PAGEloadingbuffer，混匀；2)80-90度加热10分钟，变性蛋白。此处样品可保存于4或-20度。二．SDS-PAGE蛋白胶配制及电泳1.SDS-PAGE蛋白胶配制✓分离胶浓度越高，分辨率越高；即蛋白之间分子量差异越小，需要越高浓度的分离胶才可将其分离开。常规使用8-10%分离胶。✓每块1.0mm胶需要准备5ml分离胶和3ml浓缩胶。✓过硫酸铵APS溶液易失效，若4度保存超过1个月，请及时重新配制；✓配制好的胶，若暂时不用，及时用保鲜膜包裹，置于室温或4度，以免失水变性。1)组装制胶用玻璃板，固定于制胶底座上；2)配制分离胶：向50ml离心管中，按配制表依次加入各组分，轻轻颠倒混匀（TEMED用量可增加2-5倍以缩短凝胶时间）。尽快向玻璃板腔加入4-4.5ml胶液，然后轻轻加入0.5-1ml90%异丙醇水溶液。静置20-40分钟以凝固胶液。略倾斜制胶底座，胶面不倾斜，即已凝固。3)分离胶凝固后，倒去上层异丙醇溶液，用水洗涤若干次，以彻底清除异丙醇残留。4)配制浓缩胶：向50ml离心管中，按配制表依次加入各组分，轻轻颠倒混匀。尽快向玻璃板腔加入胶液，以胶液刚溢出为准，插入制胶梳子（先插入一端，再逐渐插入另一端）。静置10-30分钟以凝固胶液。凝固后即可取下玻璃板，使用或保存。2.SDS-PAGE蛋白胶电泳✓SDS-PAGErunningbuffer电泳液可重复使用，但以不超过10次为宜。✓一个电泳槽最多可同时进行4块蛋白胶电泳，请按电泳槽上的指示线加入适量的电泳液。1-2块胶须加到下指示线，约600ml；3-4胶须加到上指示线，约1100ml。✓1.0mm蛋白胶每孔上样最多30ul；若超出此体积，须先上样一部分，电泳1-2分钟之后，再上样余下部分。✓按电极颜色指示安装电泳槽，以免颠倒正负极。✓一般电泳，电压可用60-200V；电压越高，电泳越快，但发热越多，条带可能变形。1)组装电泳内槽。（可先加满水静置1-2分钟，以测试是否漏液；明显漏液须重新组装；无明显漏液，倒去水，进行下一步）2)上样：将组装好的电泳内槽置于电泳槽中，向内槽中加满runningbuffer；双手平衡用力，垂直拔出梳子（若上样孔有蛛网状残胶，可用200或1000ul移液器轻轻吹洗）；用10ul移液器，向上样孔中加入制备好的蛋白样品（见一.5）及蛋白marker。3)电泳：向外槽加入runningbuffer至指示线；安装电泳槽盖，接通电源；100-120V电泳。目的条带被很好地分离时，即可停止电泳。4)回收内外槽电泳液。5)用水冲洗内外槽，以去除残留电泳缓冲液，利于转膜。三．WesternBlot1.SDS-PAGE蛋白胶转膜✓transferbuffer转膜液含20%甲醇。可重复使用，但以不超过5次为宜。✓一个电泳槽最多可同时进行2块蛋白胶转膜，约需1000mltransferbuffer。✓转膜液须提前在4度或冰中预冷。✓PVDF膜须用甲醇浸泡湿润活化1-2分钟，方可使用。NC膜不需此步。✓转膜过程易产热，为加速散热，可将转膜槽置于装有冰水混合物的盒子或盆子中。✓转膜电压越高，转膜越快，但发热越严重。✓蛋白分子量越大，所需转膜时间越长。1)蛋白胶、滤纸、印记膜均须在转膜液中浸泡平衡1-2分钟，方可进行组装。2)用胶铲轻轻撬开玻璃板，切除浓缩胶，留下分离胶备用。3)组装：在转膜夹黑色板上，按以下顺序逐层叠加：海绵，滤纸（薄滤纸用3层），蛋白胶，膜，滤纸（薄滤纸用3层），海绵；合上转膜夹透明板，固定卡好。每一层叠加时，可滴加少许转膜液，以避免气泡；若滤纸、胶、膜之间有气泡，须用玻璃棒从中间向四周轻轻赶压，去除气泡。4)转膜：将组装好的转膜夹装入转膜内槽，注意转膜夹黑色面对准内槽黑色面，保证正确电极方向；组装好的内槽放入外槽；外槽中放入冰袋，然后加满转膜液，以不溢出为准。将外槽置于适量冰水混合物中，合上盖子，接通电源；90V转膜60-90分钟，或100V转膜30-60分钟。5)转膜结束后，取出冰袋和转膜内槽，回收转膜液；用水清洗内外槽，去除残留转膜液体。2.膜的封闭✓取出印记膜，须用铅笔做一标记，以区分正反面。正面：指与蛋白胶接触的面。✓准备一大小合适的塑料盒子，用于膜的封闭、洗涤。✓膜的封闭、洗涤、抗体孵育时均须在脱色摇床轻轻摇动。✓blockingbuffer封闭液：用PBST配制的5%脱脂奶粉溶液。1)盒子中加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1-2分钟。2)倒去PBST，加入适量封闭液，轻轻摇动孵育印记膜30分钟。3.一抗孵育✓一抗稀释液：用PBST配制的5%BSA（牛血清白蛋白）溶液，加入0.02%叠氮钠。✓用15ml离心管配制一抗5-10ml。一抗稀释比例参考抗体说明书。✓稀释后的一抗可反复使用，用后保存于4度。反复使用时，若发现条带信号减弱，可补加1-2ul抗体原液。1)裁膜：取出印记膜，用保鲜膜包裹好；参考marker，确定待检测蛋白所在位置；用记号笔和直尺按marker指示，画出裁剪线；用剪刀裁取待检测蛋白所在的膜，用于下游实验操作。裁取膜须用铅笔做一标记，以区分正反面及区分不同的裁取膜。2)倒去封闭液，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤裁取的印记膜2-3分钟。3)用钝头镊子，将印记膜转移到相应的一抗离心管中，室温轻轻摇动孵育印记膜1-2小时；或静置于4度过夜，次日于室温轻轻摇动孵育印记膜30-60分钟。4.一抗洗涤1)取出印记膜，置于盒子中，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1分钟。2)倒去PBST，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜5分钟。3)重复上述步骤，洗涤5次即可。5.二抗孵育✓二抗稀释液：用PBST配制的2.5%脱脂奶粉溶液。✓用15ml或50ml离心管配制二抗10-20ml。二抗稀释比例参考抗体说明书。✓稀释后的二抗，2-3天内可反复使用，用后保存于4度。1)用钝头镊子，将印记膜转移到相应的二抗离心管中，室温轻轻摇动孵育印记膜1-2小时。6.二抗洗涤1)取出印记膜，置于盒子中，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜1分钟。2)倒去PBST，加入适量PBST，轻轻摇动洗涤印记膜5分钟。3)重复上述步骤，洗涤5次即可。7.显影成像1)打开成像仪器。2)配制成像检测用HRP发光底物，具体参考说明书。3)取一块保鲜膜，平整置于成像仪载物台上。4)取出印记膜，用滤纸吸干多余水分，正面朝上置于上述保鲜膜上；用移液器均匀滴加底物，参照说明书，进行孵育。5)孵育结束，成像。SDS-PAGE蛋白胶配制表常规缓冲液配方✓建议用双蒸水或去离子水配制或稀释。RIPA裂解液（强）：50mMTris-HCl,pH8.0，150mM氯化钠，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS。RIPA裂解液（中）：50mMTris-HCl,pH8.0，150mM氯化钠，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠。RIPA裂解液（弱）：50mMTris-HCl,pH8.0，150mM氯化钠，1%NP-40。10XSDS-PAGErunningbuffer（电泳液/Tris-GlycineSDSRunningBuffer）：1000mL✓使用时必须稀释成1X。配制1000ml需下列试剂：30.3gTris，144g甘氨酸，10gSDS。10XSDS-PAGEtransferbuffer（转膜液/Tris-GlycinetransferBuffer）：1000mL✓使用时必须稀释成1X，且必须加入20%甲醇。配制1000ml需下列试剂：30.3gTris，144g甘氨酸。10XPBS：1000ml✓使用时必须稀释成1X。配制1000ml需下列试剂：80g氯化钠，2g氯化钾，14.4gNa2HPO4，2.4gKH2PO4。PBST：PBS（1X）加入0.05-0.1%Tween20