新型疫苗进展

新型疫苗非特异性免疫：生物体在长期种系发育和进化中逐渐形成的一系列防卫机制。特异性免疫：个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。自然自动免疫：患传染病，隐性感染自动免疫人工自动免疫：接种疫苗，类毒素自然被动免疫：经胎盘，初乳特异性免疫被动免疫人工被动免疫：注射抗毒素，丙种球蛋白，细胞因子免疫隐性感染/患传染病接种疫苗/类毒素通过胎盘/母乳接受抗体注射抗毒素/胎盘球蛋白→自然主动免疫→人工主动免疫→自然被动免疫→人工被动免疫1739年《医宗年鉴》人痘接种法1796年英国年轻医生EdwardJenner牛痘接种法1876年德国人RobertKock首次发明细菌分离培养法1877年法国LouisPasteur减毒疫苗：鸡霍乱、炭疽1886年SalmonSmith灭活疫苗：加热灭活猪霍乱杆菌1923年法国Ramon类毒素：甲醛解毒白喉、破伤风类毒素1948年Enders病毒培养法疫苗发展简史EdwardJennerLouisPasteur①古典疫苗时期：主要建立在对感染性疾病反复观察和摸索的基础上，以牛痘苗和狂犬病疫苗为代表；②培养疫苗时期：用人胚胎非神经组织培养脊髓灰质炎病毒首先获得成功，采用组织或细胞培养技术可获得许多减毒或灭活的疫苗，以脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、卡介苗等为代表；③基因工程疫苗时期：以基因工程技术为基础，为疫苗的研制注入了全新的设计思路，最成功的例子是乙型肝炎基因工程疫苗。采用加热、甲醛等物理化学方法将病原微生物杀死制成。如乙型肝炎灭活苗、狂犬疫苗。特点：安全性好。需多次注射。但有时由于毒性的丧失，免疫原性也随之丧失。死苗大多需要佐剂才能加强免疫效果。弱毒苗（活苗，live-attenuatedVaccine）灭活苗（死苗，deathvaccine）是由被弱化了毒性、或者变异的微生物组成，在机体内只能限量生存而不致病。如卡介苗、天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗。优点：保护性效果好、不需佐剂、特别是可诱导较强的细胞免疫反应。一次免疫即可获得长久免疫力。缺点：安全性有时难以确保，即“返祖现象”；不易保存；此外免疫功能底下者接种可导致发病。传统疫苗死疫苗活疫苗制剂性状弱毒或无毒的病原微生物杀死的病原微生物接种量及次数量大，2～3次量小，1次保存及有效期易保存，较稳定有效期可达1年不易保存，4度数周失效免疫效果较差，维持数月至1年较好，维持1～5年或更长评价疫苗的三个重要指标第一：安全第二：有效第三：价廉、实用、方便概念：在分子水平上对微生物的致病本质及免疫保护机理的分析研究为基础，用现代生物技术进行生产。优点：►研究、生产及使用安全。►生产、存储及运输成本低。►疫苗制备无失活过程。研究的重点领域：►创造新疫苗：主要指用常规技术不能或难以解决的疫苗，如与感染有关的疫苗（肝炎）、肿瘤疫苗、避孕疫苗等。►改造旧疫苗：主要针对一些效果或安全性较差、或成本较高的常规疫苗。►发展多价疫苗：多价疫苗成本低、免疫程序简单，是疫苗研究的发展方向。►研究治疗性疫苗：如乙肝慢病毒感染治疗疫苗、治疗性肿瘤疫苗。新型疫苗*基因（遗传）工程疫苗*亚单位疫苗*活载体疫苗*核酸疫苗基因缺失活疫苗蛋白工程疫苗遗传重组疫苗合成肽疫苗微胶囊疫苗抗独特型抗体疫苗新型疫苗的分类用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体制成的疫苗。*天然病原体保护性抗原的获得（传统方法）：保护性单抗抗原定位亲和层析纯化蛋白氨基酸基因抗原双相电泳质谱分析氨基酸基因*从DNA或cDNA文库中筛选保护性抗原基因：免疫血清或保护性单抗阳性克隆株基因序列分析GeneBank中同源性比较表达产物免疫效果鉴定*人工化学合成保护性基因*PCR钓取*索取一、基因工程疫苗（GeneEngineeringVaccine,GeneticallyEngineeringVacine）概念保护性抗原基因获得常用方法目的基因重组载体转化转染阳性重组菌阳性重组细胞或病毒鉴定表达、纯化载体概念：将用基因工程方法表达的蛋白抗原纯化后造成的疫苗。（疫苗中已除去了病原体中不能激发机体保护性免疫和对机体有害的部分，只保留了有效的免疫原成分）。优点：主要为安全性好、特异性强及可大量生产。缺点：抗原性弱、需用佐剂、纯化工艺复杂。1.亚单位疫苗（GeneengineeringSubunitVaccine）乙肝亚单位疫苗►细菌（大肠杆菌）系统：典型的原核表达系统，具有遗传背景清楚、操作相对简单、方法成熟、周期短、表达量高等特点。一般认为具有翻译后修饰功能较差及表达产物纯化复杂的不足（主指致热原的去除）。►酵母表达系统：分类不是很明确，一般认为介于原核和真核之间。具有一定的糖基化功能，表达量也比较高。►昆虫细胞（杆状病毒）系统：属低等真核表达系统，与高等真核系统相比缺乏两种糖基化酶。►哺乳动物细胞系统：高级真核表达系统，表达蛋白的翻译后修饰功能强，能保持蛋白的立体构象。表达产量一般较低、成本也较高。►整体动物：有人形象地比喻为“生物反应器”、“动物工厂”。►植物表达系统：安全性好，由于有细胞壁，方法学上有一定难度，技术上一旦有突破，估计很有前途。系统遗传背景清楚。操作相对简单、方法成熟、周期短。表达量高、成本较低。产物纯化困难、蛋白翻译后修饰功能相对差。原核表达的特点真核表达的特点蛋白翻译后修饰功能较强，能保持天然的立体构型。表达量低，成本较高。操作相对复杂。Becloned酵母大发酵罐HBsAg蛋白vaccine第一个重组抗原疫苗HepatitisBvaccineHBsAg纯化刺激机体产生保护性抗体Protectiveantibodies利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。特点：载体疫苗多为活疫苗。纯化及生产工艺简单、成本低。可在体内繁殖并产生保护性抗原等。接种方便（口服、划痕、注射）。不需佐剂。真核载体允许插入的外源基因量大，有利于多价疫苗的研制。2.载体疫苗VectoredVaccine不需佐剂就可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应。表达蛋白的翻译后修饰功能强。允许插入的外源基因量大。病毒具有广泛的宿主细胞。纯化过程简便。对外界抵抗力强、易于保存和运输。痘苗病毒载体（Vacciniavirus）病毒DNA一般在染色体外存在，目前无病毒基因整合的证据。宿主细胞广泛，病毒稳定，生产、使用方便。可在呼吸道增殖，也可在消耗道增殖，具有制备口服疫苗的前景。腺病毒载体（Adenovirus）基因组的结构与功能研究的比较清楚。是一种强免疫剂，免疫期长，可制成口服和注射两种疫苗。目前存在问题：生长缓慢。卡介苗精确的减毒位点不清楚。细菌壁上有蜡质存在而不利于基因操作。使用结核疫苗的国家对该疫苗的使用有影响。卡介苗（Bacillus-Calmette-Guerin,BCG）可侵入淋巴系统，能更有效地激发免疫反应（很多人类病原体是通过粘膜进入体内的，口服减毒沙门氏菌可刺激粘膜淋巴细胞分泌IgA形成一道免疫屏障）。减毒鼠伤寒杆菌(Poliovirus）可口服，使用方便易大规模接种。使用活载体疫苗注意事项抗菌素对细菌性活载体有影响免疫反弹免疫低下或免疫缺陷病DNA编码致病性抗原质粒RecombinantplasmidVaccinia启动子感染痘苗病毒组织培养细胞同源性重组筛选重组痘苗载体疫苗免疫表达基因产物—免疫原免疫反应Attenuatedpoliovirus腺病毒减毒伤寒杆菌BCG减毒微生物也称DNA疫苗或基因疫苗，使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。疫苗制剂的主要成分不是基因表达产物，而是核酸（DNA或RNA）。特点：制备简单。稳定性好易于保存和运输。在体内持续表达抗原蛋白、免疫效果持续。载体本身无免疫原性。诱导细胞免疫能力较强。不存在其它疫苗在机体免疫功能低下时不能使用的限制。3.核酸疫苗（NucleicAcidVaccine,GeneVaccine）Plasmidvaccine常用的是pBR322或pUC质粒为基本骨架。只含有菌源性复制起始点。稳定性好，在大肠杆菌中有较高的拷贝数。具有能在哺乳动物细胞内高效表达的强启动子。核酸疫苗表达载体的选择核酸疫苗有待解决的问题能否产生DNA抗体？外源基因在体内的持续表达，能否引起免疫耐受、自身免疫或超敏反应？外源基因能否与机体染色体整合导致癌变？DNA免疫效力低下问题。使用分子生物学技术去除与毒力相关基因获得的缺失突变株制成的活疫苗。特点：突变性状明确、稳定。不易反祖。4.基因缺失活疫苗（GeneDelectedLiveVaccine）5.蛋白工程疫苗（ProteinEngineeredVaccine）将抗原基因加以改造，使之发生突变、插入、缺失、构型改变等，甚至进行不同基因或部分结构域的人工重组，以期达到增强其产物的免疫原性、扩大反应谱、去除有害作用或副反应的疫苗。使用遗传重组方法获得的重组微生物制成的疫苗。通常是将对人体无致病性的弱毒株与强毒株（野毒株）混合感染，弱毒株与强毒株间发生基因片段交换造成重组筛选出的疫苗株。特点：含有强毒株强免疫原性基因片段。对人体不致病。二、遗传重组疫苗（GeneticRecombinantVaccine）三、合成肽疫苗（SyntheticPeptideVaccine）用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽造成的疫苗。特点：保护机理明确。可组合不同免疫活性细胞识别位点或表位。纯度高。工艺简单，生产成本低。也称可控缓释疫苗（ControlledSlowReleaseVaccine）：是指使用微胶囊技术将特定抗原包裹后制成的疫苗。特点：稳定性好。免疫原性强，可维持高抗体水平。可口服。指使用与特定抗原免疫原性相近的抗抗体（Ab2）做抗原制成的疫苗，实际上是一种模拟抗原。特点：不含传染性物质,可大量制备。可以弥补基因工程技术无能为力的碳水化合物的不足。四、微胶囊疫苗（Micro-capsulizedVaccine）五、抗独特型抗体疫苗（Anti-iditypeVaccine）Jerne的免疫网络学说要点1.机体对抗原刺激的免疫应答是由独特型和抗独特型来调节。2.Ab1上的独特型可被自身另一些B细胞识别而产生抗独特型抗体（抗抗体、Ab2），同理，可产生Ab3、Ab4……，构成一个复杂的免疫网络，抗原的刺激犹如“一石激起千层浪”。3.一小部分Ab2（Ab2β）可能具有原来抗原的“内影象”，大部分为Ab2а（非内影象）。抗独特型疫苗种类作者病毒狂犬病毒糖蛋白Reagan等（1983）呼肠孤病毒Sharpe等（1984）HBsAgKennedy等（1984，1986）Ⅱ型脊髓灰质炎病毒Uytdehaag等（1985）新城疫病毒血凝素Tanaka等（1986）HSV-1糖蛋白DLathey等（1986）肾综合征出血热病毒米力等（1993）细菌肺炎球菌McNamara等（1984）大肠杆菌（K13）Stein等（1984）肺炎球菌Ward等（1987）原虫疟原虫Naussenzweig等（1980）非洲锥虫Sack等（1982）血吸虫Grzych等（1985）多价疫苗活载体疫苗真核表达“鸡尾酒”疫苗（表位疫苗）治疗性疫苗新型疫苗研究的发展趋势预防接种禁忌症高热急性传染病严重心血管病自身免疫病免疫缺陷病。•I期临床试验：副作用、免疫原性（20～25人）。（安全性）II期临床试验：特异免疫反应，包括体液与细胞免疫（有效性）（50～400人）。III期临床试验：保护性数据（数百、数千甚至数万人）。（保护性）新疫苗进行临床试验的GCP规范年龄①→疫苗↓出生1月龄2月龄3月龄4月龄5月龄6月龄8月龄1岁1.5~2岁3岁4岁6岁7岁卡介苗基免脊髓灰质炎活疫苗②基免基免基免加强加强百白破混合制剂②基免基免基免加强加强③麻疹活疫苗基免加强乙肝疫苗基免④基免基免风疹疫苗初免乙脑减毒活疫苗⑤初免加强⑦加强初次免疫应答：潜伏期长，抗体多为IgM，效价低，维持时间短。再次免疫应答：潜伏期短，抗体以IgG为主，效价高，维持时间长。植物疫苗是指通过食用表达目的抗原的转