本科生六个基本生物学实验

实验一：感受态细胞的制备1.原理：当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。2.实验材料2.1LB液体培养基2.20.1mol/LCaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。2.3DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）；移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱3.操作方法3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3mlLB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100mlLB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50ml离心管中。3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。3.5加入冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。3.7再加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。思考题：制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。实验二质粒转化1.原理当宿主菌接受CaCl2处理后，细胞膜通透性改变，感染细菌的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质粒大量繁殖。通过进一步实验，可获得大量的质粒DNA，以供分子生物学实验所用。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌。2.实验材料2.1，质粒GFP-SNAT2-pBK-CMVΔ（kan抗性）2.2，LB固体培养基平板(kan抗性)，LB液体培养基2.3，感受态细胞2.4，1.5ml离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理）；移液器，冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70℃冰箱3.操作方法3.1无菌状态下取新鲜感受态50μl置于无菌的1.5ml离心管。3.2每管加质粒50—100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。3.342℃热休克90s，不要摇动离心管。3.4每管加无抗生素的普通LB培养基950μl，37℃(150—180r/min)摇床，温和摇振45min。3.5用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙），将10μl菌液铺于含卡那青霉素(Kan)的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养10—14h。4.结果观察计数全皿菌落数5.写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况）6.思考题请说明每一步骤的原理：冰上30分钟、42度热休克90秒、37度温和震荡45分钟等。冰上30分钟：转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。42度热休克90秒：42度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收DNA复合物。37度温和震荡45分钟：促使在转化过程中获得新的表型得到表达实验三质粒DNA的抽提和纯化1.原理：质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。一般情况下，质粒并不是它的宿主细胞所必需的，如细胞分裂时，分裂的子细胞中不含质粒，但子细胞仍能生长分裂。然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒DNA是独立于宿主基因组以外的环状分子，对于碱的裂解具有较强的耐受性，因此，用碱裂解法可将质粒DNA与宿主的线性DNA分开。2材料2.1质粒DNA小抽试剂盒，乙醇2.2含质粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿）2.3离心管，枪头（以上物品需灭菌）；移液器，离心机3．步骤见试剂盒说明书实验四琼脂糖凝胶电泳1.原理：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。2.琼脂糖凝胶的性质：琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为40~45℃。当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖(70℃,低于双链DNA的变性温度)。3材料3.1琼脂糖，10mg/ml溴化乙锭，1kbDNAmarker3.2100ml50×TAE缓冲液：Tris24.2g,冰乙酸5.71ml，0.5mol/LEDTA(PH6.8)10ml3.36×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油3.4枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统4操作步骤：4.1将胶模槽放于水平工作台上。4.2用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。熔化琼脂糖溶液冷却至60度时，加入浓度为0.5μg/ml溴化乙锭10ul，充分混匀。4.3在胶模放置好梳子后，将具有一定温度的凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。注胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。4.4凝胶凝固后通常需要在室温中放置30——45min，小心移去梳子，并将凝胶托盘放入电泳槽。可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发，置4度保存，通常在数日之内可以使用。4.5加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1—2mm，样品孔内有气泡，用吸管小心吸去，以免影响加样。4.6将样品与上样缓冲液混合：上样缓冲液不仅能提高样品的密度，使样品均匀沉到孔底，还可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。4.7用微量移液器将样品依次加在样品孔内。4.8盖上电泳槽并通电，5V/cm2,恒压电泳，使DNA向阳极方向移动。4.9电泳完成后切断电源，取出凝胶。如果凝胶中加有溴化乙锭，可直接在紫外透射灯下观察，否则就将凝胶浸泡在0.5微克/ml溴化乙锭缓冲液中浸泡30——45min。4.10用凝胶分析系统直接观察并拍照。5.注意事项：5.1加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。5.2在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。如蒸发过多的溶液，应补充部分缓冲液。5.3气温较高或用低熔点、低浓度（小于0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳时，最好在4℃进行。6.结果观察6.1仔细观察DNA泳动的方向。6.2DNA电泳结束后，记录正常组与marker组电泳条带的相应位置。7.书写实验报告实验五DNA限制内切酶技术1.原理：限制性内切酶（即限制性核酸内切酶，简称限制酶或内切酶）是一类能识别双链分子中特异核酸序列的水解酶，这类酶的发现和应用，促进了基因工程和DNA序列测定以及基因诊断技术的发展。它的应用是当代分子生物学研究最基本、最重要的技术手段。从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子，必须经过酶切、电泳分离、回收基因片断，方可用于重组或探针标记。根据酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。2．实验材料2.1质粒SNAT1-PBK-CMV⊿(600ng/ul，150ul)2.2限制性内切酶EcoRI2.31kbDNAmarker2.4离心管，枪头，移液器，离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳所需材料3.小量酶切反应体系本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20μl体积中含0.2—1μgDNA，酶切反应体系如下：质粒DNA5μl10×缓冲液1μl限制酶（根据质粒酶切位点选择）1μl双蒸去离子水3μl总体积10μl4.操作方法4.1在一灭菌的新的Ep管中加入3μl双蒸水。4.2加入10×缓冲液1μl。4.3加限制酶1μl。4.4最后加入质粒DNA5μl。4.5稍离心，混合。4.637℃水浴1—1.5h。4.7取出后电泳分析鉴定是否酶解。5.注意事项5.1双蒸水为可变体积，当其他反应成分的量确定后，用双蒸水将反应体积补足。5.2质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。5.3为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎冰中冰浴，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。5.4大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取用多种酶，每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。5.5大多数限制酶均加50%甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。5.6如欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现异常条带。5.7当样品加入反应管之后，必须将装酶试管盖盖严，避免温育时水蒸汽进入管内。6.结果观察6.1DNA分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。仔细观察条带数量。6.2.与Marker对照，观察各条带中的bp数。6.3.书写实验记录并画图记录各条带的位置。实验六PCR技术1.原理：PCR技术实际上是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。整个扩增过程分为三步：①变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火：突然降温后，模板DNA与引物按碱基配对的原则互补结合。也存在2链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要结合发生在模板与引物之间；③延伸：在DNA聚合酶及镁离子存在时，从引物的3`端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的DNA链。上述三步为一个循环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为下一轮模板链循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。2.操作方法针对本次实验的实验材料，体系和条件如下：PCR产物约800bp（一）材料：2×Taq聚合酶：康为世纪模板：GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿（56ng/ul）上游引物：12.5uM，35ul（5，-3，CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG）下游引物：12.5uM，35ul（5，-3，CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG）（二）10ul体系：ddH2O：2.36ul2×Taq聚合酶：5ul上游引物：0.67ul下游引物：0.67ul模板：1.3ul总体积：10ul（三）PCR条件：1,