15-16高中生物人教选修1课件：52多聚酶链式反应扩增DNA片段

1新情境·激趣引航PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。例如梅毒。2新课堂·互动探究学习目标1.尝试PCR技术的基本操作。2.使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法。3.理解PCR的原理。4.讨论PCR的应用。新知预习一、PCR原理1．概念：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2．DNA复制需要的条件：解旋酶、DNA母链、4种脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物。激趣应用1DNA复制为什么还需要引物？提示：DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3．DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。4．PCR反应的条件一定的缓冲溶液；DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物；四种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；控制温度。二、PCR反应过程1．变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链，一般实验温度为95℃。2．复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，一般实验温度为55℃。3．延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在Taq_DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。激趣应用2——细胞内的DNA是怎样复制的？(1)回忆并简述DNA的复制过程。(2)PCR的变性过程实质上也是解旋，PCR的解旋和细胞内的DNA解旋有何不同？提示：(1)DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链，随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。(2)PCR在高温条件下(90～100℃)解旋，而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋。三、实验操作1．PCR仪：能够自动调控温度的仪器，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个恒温水浴锅代替，操作时在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。2．微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5_mL。3．微量移液器：用于添加转移PCR配方中的液体。四、操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。3．微量移液器的枪头在吸取试剂后必须更换。激趣应用3——DNA在吸附性方面有何特点？DNA很容易吸附在玻璃的表面，而不容易吸附在塑料的表面，由此推测PCR用到的微量离心管是用何种材质加工制作的？提示：是用塑料加工制作的。3新课堂·互动探究知识点一生物体内的DNA复制与PCR反应的比较细解教材体内DNA复制PCR反应时期细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期体外随时进行场所活细胞内细胞外酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增是否需缓冲液不需缓冲液严格配制10倍浓缩扩增缓冲液不同点设备无严格控制温度变化的温控设备原料4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)复制原理严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制模板以DNA母链为模板相同点引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物特别提醒(1)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。典例精析2015·华中师大附中期中下列关于PCR与DNA分子在细胞内复制的相关说法正确的是()A．解旋的原理一样B．引物的合成一样C．PH条件的要求一样D．酶的最适温度不一样【解析】PCR技术的概念是PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)，具体过程有①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开，C正确。【答案】C跟踪练习1．如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是()A．模板B．原料C．酶D．能量供应【解析】本题主要考查细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的知识，意在考查考生对细胞内外DNA复制条件的理解。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的Taq酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。【答案】B知识点二PCR操作细解教材1．PCR解旋与复旋的原理：DNA热变性与复性：2．PCR的反应过程(如图)：3．PCR扩增的计算与DNA含量的测定：(1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个DNA；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。(2)DNA含量的测定：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：特别提醒(1)PCR过程中无解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。(2)复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。典例精析2015·华中师大附中期中PCR技术扩增DNA片断，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列说法正确的是()A．从理论上推测，第一轮循环产物中就能得到含引物对的DNA片断B．至少完成两轮循环，才能获得两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C．三个循环后可得到5种长度的DNA片断D．30次循环后，所有的DNA单链上都有引物【解析】由于引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，A错误；由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，B错误；三个循环后可得到5种长度的DNA片断，C正确；30次循环后，不是所有的DNA单链上都有引物，D错误。【答案】C跟踪练习2.2015·吉林一中质检下列有关PCR技术的叙述，错误的是()A．PCR技术一定需要解旋酶和DNA聚合酶B．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链C．PCR的引物的基本单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸D．扩增DNA时，需要加入两种引物【解析】PCR需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，B正确；PCR中需要两种不同的引物，引物一般为一段DNA或RNA，基本单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸，CD正确。【答案】A4新思维·随堂自测1.PCR技术扩增DNA，需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥【解析】PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料。综上所述，A正确。【答案】A2.2015·华中师大附中期中下列关于PCR的描述中，正确的是()①PCR是一种酶促反应②引物决定了扩增的特异性③扩增DNA利用了热变性的原理④扩增的对象是氨基酸序列A．①②④B．②③④C．①③④D．①②③【解析】PCR技术的概念是PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，原理是DNA复制，前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，条件还包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)，具体过程有①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。【答案】D3.2015·扬州中学考试在PCR扩增DNA的实验中，预计一分子DNA经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么不是出现该现象的原因是()A．TaqDNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制B．系统设计欠妥C．循环次数不够D．引物不能与亲链结合【解析】PCR扩增没有得到应有的DNA分子数，有可能是TaqDNA聚合酶活性不够或活性受抑制，可能形成的DNA少，故A正确。系统设计欠妥会导致达不到预期的结果，故B正确。循环次数不够会出现子代DNA分子数少，故C正确。引物与亲链不能结合的情况下不会出现子代，而不是少，故D错误。【答案】D4．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：____________________________________。(2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要____________________、和__________________、__________________等条件。(3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次(即复制三次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是__________________和______________个。DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对四种脱氧核苷酸能量酶2453155．将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。(1)第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的原因是__________________________________________________________________________。(2)如果将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的________%。(3)如果将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA脱氧核苷酸单链约占总量的________________%。它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板，通过碱基互补配对原则合成的50256新视点·名师讲座PCR的常见问题PCR技术实验很容易出现假阴性或假阳性的结果。常见的原因及预防措施是：(1)出现假阴性主要原因有：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制