中药粉末显微鉴别技术

1中药粉末显微鉴别技术第一节取样、制片、染色一、取样取样的代表性直接影响到结果的判断准确，因此必须重视取样的各个环节。（一）对照品对照品粉末是检定供试品的参照物，其制备是显微鉴别的先决条件。有经验者，可自取标本，鉴定后制作，或购买药材经品种基原鉴定。还应注意有些药材的显微特征受生长年限及环境的影响，会产生一定的波动，所以对于供试品的产地、采收期、加工方法等也应当认真记录。（二）供试品中药材原药材应注意基原、产地、规格的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，并详细记录。（1）从同批药材包件中抽取有代表性的检定用样品。（2）对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材，一般药材100g-500g；粉末状药材25g；贵重药材5g-10g；个体大的药材，根据实际情况抽取代表性的样品。（3）将所取有代表性样品混合均匀，即为总样品量。（4）前处理：将供试品捡净后，用量较小时，可以用乳体或小型电磨粉碎过《中国药典》6号筛（1.0μm-250μm）备用。1、中成药（1）取样：从各批号的箱、包、瓶中随机取样，记录好厂家、批号，从各包装盒中任意取1丸，每批号不得少于3次。各供试品留样保存，保存期限至少1年。水丸无包衣时，可直接取2丸-3丸，乳钵中研成细粉后，取少量置裁玻片上，滴加规定的试液，搅拌均匀，使粘结的细胞、组织分离，再按粉末特征加水合氯醛试液或其他适当试液处理后观察。水蜜丸或大蜜丸；可直接用刀片横向切开取一薄片，或用小钢铲取一小块（约15mg）放置在载玻片上制片观察。（1）去包衣：中药片剂常见包衣为糖衣，隔离层常使用胶浆、糖浆和滑石粉。水丸和糊丸等（挂）衣的材料有滑石、蔗糖、朱砂、雄黄、青黛、百草霜、礞石、赫石等。可用刀片将包衣剥去，简单的办法也可将片剂或丸剂断为两半，直接取内心，粉碎进行观察。（2）添加剂：为便于观察，可对中成药的制造过程中使用的添加剂做适当的前处理。除去水溶性干扰物：将检品置于蒸馏水中研匀，离心处理，取沉淀物检查。除去脂溶性干扰物：将检品滴加适量氯仿，离心处理，取沉淀挥干氯仿后检查。除去淀粉，糊化淀粉的干扰：将检品滴加蒸馏水研匀，置烧杯中煮沸、冷却，离心处理，取沉淀检查。以上操作中，为防止某些显微特征的流失，应进行留样观察。二、制片（一）制片1、载玻片与盖玻片载玻片与盖玻片是影响图像质量的因素之一。因载物台下的聚光器是按使用一定厚度的载玻片设计的。首先应选择规格统一的载玻片（厚0.9mm-1.2mm）与盖玻片（厚0.12mm-0.17mm）。使用前，将载玻片与盖玻片用无水乙醇浸泡后，用柔软的绸布或无纤维人造纸揩擦，至表面洁净无暇。2、制片将供显微观察的粉末药材或样品置于载玻片上，然后加入适宜的试液1滴，用玻璃棒搅匀，用镊子将盖玻片沿一侧轻轻放下，使液体自然展匀即可。可用滤纸吸拭溢出的液体或从盖玻片边缘补充液体不足的空隙。（二）制片按使用试剂分类1、稀碘液制片主要用于观察含淀粉粒。2、斯氏试液制片试液由醋酸：甘油：水（1：1：1）组成。用于观察包括淀粉粒在内的所有显微鉴别特征。3、水合氯醛制片水合氯醛试液能渗透组织，使皱缩的细胞膨胀并能溶解淀粉粒、蛋白质、树脂、挥发油和叶绿素等，使细胞组织变得透明而清晰。24、乙醇装片在观察的切片中有菊糖、粘液、树胶等时，使用95%以上的乙醇。（三）制片按保存时间分类1、临时制片封藏介质一般为流动性液体，不耐久藏。但制作简易、适用于一般的显微观察及显微化学反应。2、半永久性制片在上述临时制片周围，直接使用加拿大树胶，将盖玻片周围封严，室温放置1天干燥后，置冰箱内，一般可供10年以上观察使用。封藏介质还可以选用半固体的甘油明胶。3、永久性制片封藏介质一般呈固态，可长期保存，但制作费时，多用于教学标本。制作方法一般是先将粉末用无水乙醇浸润，随后沥去乙醇，用二甲苯浸润，再沥去二甲苯，滴加加拿大树胶的二甲苯溶液后，自然挥发干燥固定后即可。三、染色为使标本片特征显著，可根据细胞壁及细胞内含物的性质，加入不同染色剂染色。常见的显微化学反应如下（所有试液的配制方法参见《中国药典》）。（一）细胞壁性质的检定1、木化细胞壁，加间苯三酚试液1滴-2滴，稍放置，加盐酸1滴，因木化程序不同，显粉色、红色或紫红色。此操作最好在水合氯醛透化后再进行，其效果较好。2、木栓化或角质化细胞壁，加苏丹III试液，稍放置或微热，呈橘红色至红色。3、纤维素细胞壁加氯化锌碘试液，或先加碘试液湿润后，稍放置，再加硫酸溶液（33-50）显蓝色或紫色。（二）细胞内含物性质的检定1、淀粉粒加稀碘试液，呈蓝色或紫色。2、糊粉粒（1）加碘试液，呈黄棕色。（2）加硝酸汞试液，呈砖红色（材料中如含有多量脂肪油，宜先用乙醚或石油醚脱脂后进行）。3、脂肪油、挥发油和树脂（1）加苏丹III试液，呈橘红色，红色或紫红色。（2）加90%乙醇、脂肪油和树脂不溶解（蓖麻油及巴豆油例外），挥发油则溶解。4、菊糖加10%α-萘酚乙醇溶液，再加80%硫酸1滴-2滴，显紫红色并很快溶解。5、粘液加钌红试液，呈红色。6、草酸钙结晶（1）加稀醋酸不溶解，加稀盐酸即溶解但无气泡发生。（2）加硫酸（1-2）逐渐溶解。片刻后析出针状硫酸钙结晶。7、碳酸钙（钟乳体），加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。8、硅质加硫酸不溶解。第二节显微镜及显微摄影为能如实地记录，客观地反映中药材粉末的显微鉴别特征，掌握显微镜摄影技术是十分重要的。一、显微镜显微镜主要是由机械部分与光学部分组成，虽然新型显微镜不断面市，但其原理及各部分的构造均大同小异。（一）机械部分主要包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换盘、焦距调节装置等。1、镜座用于保持显微镜的稳定与平衡。2、镜臂用于支持镜筒及取放显微镜时便于握持之用。3、镜筒为一中空的金属圆筒，用以固定物镜与目镜用的距离。现以双筒倾斜式为常见。4、载物台用于放置载玻片之用，并有夹压片固定。装置较完善的显微镜，载物台一侧附有旋钮，可控制载玻片前后左右的移动。34、物镜转换盘具有3个-6个螺旋品，每个螺旋品配置有不同放大倍率的物镜。5、焦距调节装置通过镜筒与载物台的升降，调节物镜与标本间的距离。主要包括粗调节器和细调节器2个部分。（二）光学部分主要由一系列的放大透镜组合而成。除了主要用于放大的透镜组外，尚有光密度调节装置、滤光片、光源装置等。1、物镜物镜是决定显微镜性能的最重要部分，内装有多组复式透镜。2、目镜内装有一组放大率较小的透镜组。其作用在于将物镜所成图像作进一步的放大。3、光密度调节装置（1）聚光器：由数片透镜组成，位于载物台下方，用于将光线集中到所要观察的标本上。聚光器的一侧，尚装有升降调节轮，供会聚光线密度所用。聚光器的光阑开孔最好为物镜数值孔镜的60%-70%。（2）场光阑：位于光源的上方，主要功能是靠减少物镜反射光斑来控制图像的光。二、显微摄影1、镜头的选择（1）物镜：显微照像时，必须选用平场消色差镜或平场复消色差物镜，如带有广视野的物镜则更优。（2）目镜：应选择生产厂家原配置的照像专用目镜。2、取景与对焦现常用者多为专用的显微摄影装置。这类装置主要由一个取景目镜和一个目镜照像机组成。3、显微照明现一般的显微镜均附有透射式中心照明光源，即采用了柯勒照明法，以获得强而均匀的照明。4、滤光片为减少显微镜观察所造成的疲劳，一般装在光圈上端的滤光片架内，放置一个中等密度的滤光片可以减弱图像的亮度，达到令人舒适的光亮程度。5、曝光控制显微摄影的装置中，多具有自动曝光控制功能，以PM-10AD10全自动显微照像装置为例。在曝光操作盘上，装有下列操作钮。胶片尺寸与选择钮：可选择35mm胶片到大尺寸照片。胶片感光度设定：ISO设定钮。胶片倒易失效校正钮：参考微机处理机上所附有的常用牌号胶片倒易率失效特性数据，将旋钮拧到所用胶片的位置，即可自动地调节曝光时间。标本暗视野补偿钮：根据视场内的标本分布的明暗反差状态，把胶片的有效感光速度在额度值的0.25-4之间转换。摄影方式选择钮：选择自动或手动方式。三、其他注意事项1、显微镜的使用使用显微镜观察时，应当注意两先两后，即先低倍、后高倍、先粗调、后微调。2、显微镜的维护应特别注意防尘、防潮与防腐。避免载玻片上滴加过多的液体试剂，避免试剂流出引起腐蚀。3、显微测量法鉴定药材粉末时，一般需要采用显微长度测量的方法。长度的测量时，需要用2种标尺，即台测微尺与目测微尺。台测微尺为显微长度测量的标准，用于校正目测微尺的长度。全长1mm，分10个大格，每个大格再分为10个小格，故每个小格相当于10μm。目测微尺为一圆形的小玻片，一面印有标尺，长度通常为1cm，分为100个小格，使用时注意将有刻度的一面朝下。4.胶片的选择显微标本一般都是静态的，所以胶片的感光度并不重要。彩色胶片分日光型和灯光型，只要在光路中置一正确的滤光片使照明调节到日光光质，不论哪一类都能在显微摄影中成功地使用。胶片的有效期限，在包装盒上印的有效期限之前使用，过期胶片易发生色平衡的变化。5．冲扩冲扩为最后一步，把握不好，将功亏一篑。自己冲洗时，应认真做好观察记录。送到照像馆扩印时，应同时附上样片，照片后一般自动记录有显影条件，可供调试冲扩条件时参考。6．图像欠佳的原因图像不清晰时，应检查一下显微镜的微调焦方面是否有“滑轮”现象。是否因按快门4时过重或太快造成震动。取景目镜中的双十宇线是否看清。如有油迹出现在物镜前透镜上，或标本的载玻片上，则图像是模糊的。照片亮度不匀时，应检查一下照明器及其里面的光源与显微镜是否成一直线，如照明不均匀，将对所拍摄照片有明显影响，其背景或检体的图像常一边偏暗。中药材粉末及中成药的显微鉴别第一节中药材粉末显微鉴别要点生物的各种组织形态均具有较为稳定的显微特征，中药材被粉碎时，其组织、细胞、内含物等依然可见。了解并掌握这些基本特征，是开展中药粉末鉴别的基础。一、根及根茎类药材根及根茎类药材的粉末显微鉴别，以具有特征性的后含物、厚壁组织、分泌组织为观察重点，其次是导管、木栓细胞等。1．细胞后含物（1）淀粉粒：其形态随植物种类而异。观察时，应注意淀粉粒的多少，形状、类型、大小、脐点形状及位置，层纹等特征。(2)菊糖：为菊科、桔梗科植物药所特有。(3)结晶：大多为草酸钙结晶，偶有含硅质块的。2．分泌组织如有分泌细胞、分泌腔(室)、分泌管(道)及乳汁管等类型。3、厚壁组织(])纤维：常分为韧皮纤维和木纤维两大类。其中木纤维又分为韧型纤维和纤维管胞。(2)石细胞：多成群或单个散在，有的与木栓细胞或薄壁细胞相连接，如苍术等。观察时，应注意石细胞的形状，大小、细胞壁增厚形态和程度，纹孔形状及大小、孔沟密度等特征。4．导管导管多为梯纹、网纹或具缘纹孔，少为螺纹和环纹。5．木栓组织双子叶植物根和根茎中常见，单子叶植物根茎中少有存在。6．后生皮层仅见于为数不多的双子叶植物根和单子叶植物根茎。7．表皮及下皮表皮一般在单子叶植物药材中较普遍，双子叶植物药材仅见于较细长的须状根。8、内皮层细胞多见于单子叶植物根、根茎类粉末中，如泽泻等。少数双子叶植物的根具有分隔的内皮层细胞，如龙胆等。9．薄壁细胞包括皮层、韧皮部、木质部、射线及髓部的薄壁细胞。薄壁细胞中的后含物或特殊物质是重要的鉴别特征，如熟地黄具黑棕色核状物的薄壁组织等。二，皮类药材主要指木本植物形成层以外的部分，显微鉴别时，以观察厚壁细胞、木栓组织等为重点。1．木栓细胞大多为棕色，极少数浅红色或紫红色，少数无色，常有不同颜色的后含物。木栓细胞表面观大多为多角形，细胞壁栓质化；也有的细胞壁呈不均匀木化增厚，并具纹孔，形似石细胞．如肉桂等。2．纤维普遍存在。应注意是单个散在或成束，颜色、形状、直径、长短、壁增厚的程度，纹孔及孔沟形状等特征。同时注意有无晶纤维，如黄柏等。3．石细胞较普遍存在。应注意形状、大小、颜色，细胞壁形态、有无分枝、有无内含物等特征。4．射线细胞多碎断。应注意观察射线细胞的宽度和高度(有时破碎不易看清)、细胞内含物等特征。5．筛管为皮类药材的标志，观察其分子端壁的筛板及筛域的分布状态，如厚朴等。裸子植物皮类药材无筛管，而有筛胞，如土荆皮等。此外，还应注意分泌组