液相教程之液相色谱柱应用基础

©2008WatersCorporation液相色谱教程液相色谱教程液相色谱柱液相色谱柱应用基础应用基础©2008WatersCorporation2高效液相色谱柱简介高效液相色谱柱简介¡色谱柱是一根填满填料的管子¡柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同¡管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类—硅胶基质—聚合物基质¡色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术©2008WatersCorporation3C18C18填料的合成填料的合成(1)(1)Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)传统硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口硅羟基©2008WatersCorporation4C18C18填料的合成填料的合成(2)(2)键合相(配体)：C18残留硅羟基端基封口基团硅胶基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口©2008WatersCorporation5对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((一一))¡键合相化学—影响化合物的分离度：α—不同键合相对不同种类的化合物分离不同—可能导致色谱的分离机理不同—如：C18、C8、CN©2008WatersCorporation6键合相色谱柱键合相色谱柱¡以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相¡优点∶—固定相稳定，不易流失—应用广泛，可使用多种溶剂—消除硅羟基的不良影响¡缺点∶—pH值不能小于2(键合相水解)—同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同©2008WatersCorporation7带有内嵌极性配体的色谱填料带有内嵌极性配体的色谱填料OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3CH3传统直链烷基配体(由一步合成过程而来)§WatersSymmetryShieldRP18…©2008WatersCorporation8不同色谱填料的选择性差异不同色谱填料的选择性差异©2008WatersCorporation9¡填料的品牌-不同硅胶颗粒基质o密度，表面积，孔径o纯度(残留硅羟基活性不同)¡键合相的种类:C18,C8,ShieldRP18…¡不同C18配体键合水平o单键键合,双键键合,三键键合o配体覆盖率(疏水性不同)选择性差异来源选择性差异来源©2008WatersCorporation10对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((二二))¡填料的端基封口—封口残余硅羟基—减少不可逆吸附或拖尾—增加碳含量（0.1%-1%）©2008WatersCorporation11残基处理的效果残基处理的效果NovaPakC18未封口C18①抗坏血酸②烟酰胺③对氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黄素⑥苯酚⑦盐酸硫胺©2008WatersCorporation12对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((三三))¡含碳量–含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）¡高含碳量–有利于不易保留的化合物的分离–水解稳定性好，重现性好–有利于极性化合物的拖尾改善¡低含碳量–有利于分析中性及碱性化合物–降低溶剂损耗©2008WatersCorporation13不同色谱柱的含碳量不同色谱柱的含碳量色谱柱色谱柱C%C%kk'苊苊(50/50(50/50的乙腈的乙腈//水水))SymmetryC181917ZorbaxODS1715.7LiChrosorbRP-181510.3SymmetryC81212.5ResolveC-181212.4UltrasphereODS1111.3PartisilODS-31112.0μBondpakC-18107.9Nova-PakC-1875.5©2008WatersCorporation14对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((四四))¡平均颗粒度，颗粒度分布—颗粒度o颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)—颗粒分布o颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)—颗粒形状o球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀o无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀谱带扩展©2008WatersCorporation15硅胶颗粒的形状硅胶颗粒的形状¡不规则形状(Irregular)—大硅胶颗粒研磨，筛分—颗粒尺寸和表面积限制¡球形（Spherical）—目前流行的分析填料—更好的性能，重现性©2008WatersCorporation16对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((五五))¡平均孔径/孔体积¡孔径/孔体积分布—大的孔径可分析高分子量的分子©2008WatersCorporation17硅胶的孔结构硅胶的孔结构Si-OH=硅羟基（Silanol）无孔填料非常大300–1,000Å(30-100nm)10,000125-200Å(12.5-20nm)3,000–10,00060-130Å(6-13nm)3,000推荐使用的填料孔径被测物分子量(MW)注意：孔径是分布值§孔占据大于99%的填料表面©2008WatersCorporation18对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((六六))¡硅胶的活性—主要影响碱性化合物的保留行为：k'—生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同—是选择性差异的主要来源¡硅胶的杂质含量—重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小—是色谱柱质量好坏的重要标志©2008WatersCorporation19对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((七七))¡填料的pH稳定性—硅胶填料pH：2-8—聚合物填料pH：2-12—杂化硅胶填料pH：2-12¡pH值小于2时键合相水解¡pH值大于8时硅胶溶解123456789pH硅胶的溶解曲线©2008WatersCorporation20WatersWaters全新的柱填料颗粒全新的柱填料颗粒优点缺点无机基质(C18–硅胶)•机械强度高•柱效高•保留稳定•有限的pH应用范围•对碱性分析物拖尾•化学不稳定性有机基质(高聚物)•很宽的pH应用范围•无离子型作用•化学稳定性好•机械强度不佳•柱效低•保留行为难以预测杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)©2008WatersCorporation21四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters专利技术荣获2000年全球R&D100大奖第一代杂化颗粒的合成过程第一代杂化颗粒的合成过程©2008WatersCorporation22为何杂化颗粒柱可增加在高为何杂化颗粒柱可增加在高pHpH下的柱寿命？下的柱寿命？•硅胶快速溶解•严重的柱失效•柱寿命短暂SurfacemodifiedSilicaParticles•因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓•柱寿命大大延长XTerra®HybridParticles普通硅胶柱基于杂化颗粒的Xterra柱©2008WatersCorporation23XBridgeXBridge::第二代杂化填料的合成第二代杂化填料的合成硅胶基体中插入的桥式乙基Anal.Chem.2003,75,6781-6788美国专利号6,686,035B2Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn©2008WatersCorporation24挑战性流动相:0.02NNaOHpH12.3,50°C测试时的流动相:50/50(v/v)乙腈/水,50°C标准测试物:苯癸酮01020304050XBridge™C8XBridge™C18XBridge™PhenylXBridge™ShieldRP18XTerra®MSC18Symmetry®C18要使柱效降低一半,需将色谱柱曝露在0.02NNaOH(pH12.3)和50℃下的小时数将高将高pHpH柱稳定性推向新极限柱稳定性推向新极限©2008WatersCorporation25¡磷酸拥有三个pKa:pK1=2.15,pK2=7.2,pK3=12.3¡磷酸缓冲盐系统具有超低的紫外吸收,对从事非LC/MS分析的科学家具有很大吸引力¡持续有科学家寻求在以上三个pH范围均可稳定使用的分离柱¡“如果你能提供具有以上能力的色谱柱,我肯定会购买它!”—从许多色谱学者得到的反馈¡X-Bridge系列柱是目前唯一提供这一可能的色谱柱!将高将高pHpH柱稳定性推向新极限柱稳定性推向新极限能否使用高pH磷酸缓冲系统(pH12)??©2008WatersCorporation26对色谱柱填料的了解对色谱柱填料的了解((八八))¡填料的热稳定性—普通硅胶填料柱温:≤60℃—聚合物填料(高温GPC)柱温:≤150℃—杂化硅胶填料(XTerra)柱温:≤90℃©2008WatersCorporation27液相色谱柱的分类液相色谱柱的分类¡从柱子类型上分：—分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合¡从柱体积及柱结构上分：—内径：2.1mm以下(微径柱)、3.9mm~7.8mm(分析柱)、7.9mm~50mm（制备柱）—长度：5cm~60cm¡从柱体材料上分∶—不锈钢（普通/可换柱芯）—玻璃—聚合物（径向加压）、PEEK©2008WatersCorporation28WatersWaters反相色谱柱技术平台反相色谱柱技术平台112pH极性、亲水性化合物专用柱–Atlantis™dC18–Atlantis™HILICcolumns杂化颗粒柱–XTerra®–ACQUITYUPLC™–X-Bridge™超纯硅胶柱–Symmetry®–SymmetryShield–SunFire™28pH28pHNEWNEW©2008WatersCorporation29特殊应用的色谱柱简介特殊应用的色谱柱简介¡糖及其它碳水化合物的分析—离子交换柱(钙基/Ca)o用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析o柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求用户另置超纯水系统—氨基类型柱o分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10,用途较为广泛，主要用于食品中糖的分析—反相类型柱—硅胶类型柱—体积排除(凝胶/GPC)类型柱©2008WatersCorporation30特殊应用的色谱柱简介特殊应用的色谱柱简介¡生命科学专用柱(1)—蛋白，多肽的分析和提纯oProtein-Pak系列凝胶柱oProtein-Pak系列离子交换柱•弱阴离子/DEAE弱阳离子/CM•强阴离子/Q强阳离子/SPo疏水回受柱o亲合色谱柱o反相柱—DNA分析，同蛋白分析相近，但有些专用柱©2008WatersCorporation31特殊应用的色谱柱简介特殊应用的色谱柱简介¡生命科学专用柱(2)—糖蛋白的寡聚糖分析及纯化o离子交换柱(酸性)，Glyco-PakDEAEo分配柱(中性)，Glyco-PakN(7.8×300mm)oCarbohydrateAnalysis—儿茶酚胺分析柱oResolveC18(传统方法)、SymmetryC8—氨基酸分析柱o离子交换柱o反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法©2008WatersCorporation色谱柱使用与保养色谱柱使用与保养©2008WatersCorporation33色谱柱的连接色谱柱的连接¡各种锥箍和管路接头长度示意图:©2008WatersCorporation34色谱柱的连接色谱柱的连接¡Stop_depth长度不合适造成柱前死体积—柱外扩散,造成色谱峰展宽死体积正常峰扩散©2008WatersCorporation35色谱柱的连接色谱柱的连接¡锥箍锥度不合适造成渗漏©2008WatersCorporation36测柱效测柱效--良好的色谱实验习惯良好的