第四章细菌的分型及其检测技术

1第四章细菌的分型及其检测技术邵丽军2表型分型技术基因分型技术色谱与质谱技术细菌自动化鉴定技术血清学分型、生物化学分型、噬菌体分型、细菌素分型、耐药谱分型等质粒图谱分析、聚合酶链式反应技术、核糖体分析、染色体酶切物脉冲场凝胶电泳分型、序列分型、多位点序列分型技术等。细菌分型气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳技术、飞行质谱技术等。自动细菌鉴定和药敏分析系统。3主要内容第一节细菌噬菌体分型技术第二节细菌素分型技术第三节细菌的药物敏感试验与分型第四节分子生物学分型技术第五节色谱和质谱技术在细菌学检验中的应用第六节细菌的自动化鉴定技术4第一节细菌噬菌体分型技术一、概述二、细菌噬菌体分型的一般原则三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术四、细菌的噬菌体分型技术五、噬菌体分型优缺点（自学）5噬菌体(bacteriophage;phage)是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存在相应的噬菌体。一、概述6噬菌体的基本形态蝌蚪形微球形（无尾）细杆形（无头）噬菌体7根据与宿主菌的关系分类毒性噬菌体(virulentphage):温和噬菌体(temperatephage):89液体培养基中固体培养基上噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用噬菌体与宿主菌共培养澄清噬斑噬菌体的作用具有种特异性，一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌；噬菌斑的形态、大小和透亮度的不同，可用于鉴定细菌的型别。10(1)细菌型别与分型噬菌体裂解特异性稳定，分型结果重复性好。(2)噬菌体具有较高分型效率，能够区分菌株间的细微差别，能满足流行病学研究的需要。(3)操作方法简便易行，实验耗时短，结果记录简明。(4)方法应能标准化，以利结果的比较。(5)所用噬菌体应易于获得较高效价，能较长时间保存，噬斑清晰、大小适中，使之便于观察和准确记录。二、细菌噬菌体分型的一般原则11（一）噬菌体分离三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术制备菌悬液噬菌体富集培养制备裂解液噬菌体确证试验接种适量样品，12-24h离心，上清过滤除菌，滤液无菌试验平板均匀涂布一层菌液，干燥后，表层布5-7点，滴加滤液，一点生理盐水，培养观察噬斑12（二）噬菌体纯化稀释裂解液制备噬菌体与敏感菌混合管培养纯化10-1至10-55个稀释度的噬菌体各0.1ml+0.2ml对数菌液，5min选取噬斑较分散的平板，挑取典型噬斑，接种至含菌体培养液中过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑3次，至平板噬斑形态大小一致制备底层琼脂平板制备上层琼脂平板各稀释度混合管+3ml半固体培养基，均匀覆盖平板表层13（三）噬菌体的增殖、保存1、噬菌体增殖2、去除菌体3、噬菌体的保存液体增殖法：定时加入对数期菌体固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度细菌滤器法和三氯甲烷法冷藏保存：无需防腐剂，分装后7d，不宜超过4w冷冻干燥：2年14（四）噬菌体的效价和裂解谱的测定1、噬菌体效价的测定噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体的数量。用噬斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）表示。单位：PFU/ml;测定方法：双层琼脂平板法152、常规试验稀释度测定噬菌体的常规试验稀释度(routinetestdilution,RTD)：是将噬菌体进行10倍系列稀释，各稀释度噬菌体溶液点在宿主菌涂布的斑点上，经培养后，能产生仅次于融合性裂解（CL）的最高稀释度。RTD测定意义：高浓度噬菌体会对宿主菌产生裂解外观，为避免噬菌体对细菌这种非特异性破坏，使分型噬菌体显示最高的特异性，将噬菌体间的交叉反应降到最低，建议使用RTD或称为临界试验稀释。RTD与PFU关系，均是噬菌体效价的计量单位。受噬斑大小的影响，一般的RTD约含1X106pfu/ml163、裂解谱裂解谱是指一种噬菌体的作用范围。即确定该噬菌体在种内或属内的广谱性，在种外或属外的交叉反应性。裂解模式是指各种细菌培养物被几种噬菌体作用而出现的特殊的反应模式，不同的细菌，可呈现不同的反应模式。裂解谱和裂解模式一般用噬菌体原液进行试验，效价在103～105RTD或109～1011PFU/ml之间。分型试验一般用1RTD的噬菌体。17制备菌悬液菌液涂布平板选点滴加不同噬菌体不能混有杂菌直接涂布或双层琼脂平板斑点滴定的结果记录如下:融合性溶解程度:融合性溶解(CL)、次融合性溶解(＜CL)、半融合性溶解(SCL)、次半融合性溶解(＜SCL)、融合性不透明溶解，中心混浊，菌苔厚(OL)。单个噬斑:大(L)即＞1.5mm、正常(N)约1.0mm、小(S)0.1~1.0mm、细小(m)＜0.1mm、微小(µ)。细小和微小均仅能用放大镜观察。噬斑的数量:0~5(-)、6~20(±)、1~40(+)、41~60(++)、61~120(+++)、120(++++)。四、细菌噬菌体分型技术18第二节细菌素分型技术细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅对与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽胞杆菌素等。抗生素抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存竞争需要而产生的化学物质,这种物质可保证其自身生存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多粘菌素、抗菌肽等。一、概述19细菌素特点抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可进行细菌分型和流行病学调查。细菌素分型方法利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细菌素敏感模式（检测未知菌）利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指示菌，测定试验菌产生细菌素的模式20（一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法（绿脓菌素为例）绿脓菌素制备绿脓菌素敏感试验细菌素分型试验有清晰抑菌圈，圈内无菌落者为完全抑菌;抑菌圈中尚有部分菌落为不完全抑菌;无抑菌圈表示该菌对此种绿脓菌素不敏感。二、细菌素分型方法待测菌铺满平板，干燥后加细菌素标准品，观察抑菌圈。21（二）平板交叉划线分型法适用于细菌素产生量不多的细菌已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，放置2cm*2cm滤纸片，滴加三氯甲烷，灭菌多种待测菌株与原产细菌素菌株成垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点上是否有菌生长，判定待测菌菌型。22（三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分型方法方法同平板交叉划线分型法已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养24-48h无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接种，培养24-48h，观察交叉点菌生长情况，判定产生细菌素试验菌菌型。23一、概述二、纸片扩散法三、稀释法四、结核分枝杆菌药敏试验第三节细菌的药物敏感试验与分型24细菌的药物敏感试验(drugsusceptibilitytest)是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验，简称药敏试验。药敏试验方法纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法（E-试验法）、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方法等。一、概述25（一）基本原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。二、纸片扩散法（K-B法）26(二)培养基和抗菌药物纸片1．抗菌药物纸片：商品化，选择直径为6.35mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封贮存于超低温冰箱。2．培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4℃保存。271.在琼脂平板上挑取形态相同的菌落4～5个，接种于3～5mLM-H肉汤中，36℃培养4～8h，与标准比浊管比较，可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同2.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致密），待干3.镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24mm，纸片距平板边缘不小于15mm。36℃温箱培养16～18h观察结果。（三）试验步骤2829（四）结果判断和报告用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。根据标准，作出“敏感”、“耐药”或“中介”的判断。几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度≤4≥8≥1513～14≤1210IU庆大霉素GEN≤0.5≥8≥2314～22≤1315IU红霉素ERY≤0.1≥2921～28≤2010IU青霉素GP-G敏感耐药敏感中介耐药相应的MIC（μg/ml）抑菌环直径（mm）纸片含药量抗生素代号30“敏感”（sensitive，S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效。“中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗效。31（五）质量控制采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药敏试验，质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结果可信。目的：检查试验条件（如培养基、含药纸片和接种菌量）、操作技术等是否合格质控标准菌株：大肠杆菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC25923等32稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。原理是用一系列不同浓度的药物与等量细菌作用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细菌的最低浓度，其结果用最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)表示P101。分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。三、稀释法33肉汤稀释法123456789101134123456789101135123456789101136特殊性：结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药物已扩散而无法影响细菌的生长。方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等。绝对浓度法:是我国实验室普遍使用方法。将浓度递减的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养4w，菌落数多于20个为阳性（据此判定MIC）。受试菌与标准菌MIC的菌落数比值≤2判为敏感，≥8为耐药。比例法：WHO、国际防痨和肺病联合会推荐的标准方法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药培养基，检测耐药性。四、结核分枝杆菌药敏试验37一、核糖体分型二、脉冲场凝胶电泳分型三、序列分型四、多位点序列分型技术第四节分子生物学分型技术38实质：核酸探针杂交分型技术。核糖体RNA（rRNA）基因最为保守，在基因组上存在多个拷贝，以rRNA基因片段为探针，检出含有rRNA基因的DNA片段，通过分型杂交后的rRNA指纹图，进行菌种分型和近源菌株的鉴定。原理：样本DNA经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转印到膜上进行Southern印迹杂交分析。以rRNA基因片段为探针，杂交产生菌株特异性的DNA指纹图，与平行样本或数据库进行比对达到分型目的。一、核糖体分型3940实验过程探针的设计：一般以16SrRNA和23SrRNA作为探针，现已商品化菌体的分离培养与DNA提取菌体DNA酶切及电泳Southern印迹杂交全自动微生物核糖体基因分型系统。优点是高效简便、快速、以标准化；缺点是费用高。41脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术是细菌分型较灵敏的方法，通过检测染色体上所有酶切位点的变化，反映全部基因的相关性，提供可靠的基因分型依据。优点：重复性好，分辨力强，是基因分型的“金标准”，在识别和追踪医院感染暴发和流行上具有实