8流式细胞术系列之-用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期

DNA倍体和细胞周期分析细胞周期和DNA倍体分析的原理G0/G1期DNA含量为2CS期细胞,DNA含量开始增加,2CG2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平2、性细胞DNA含量为1C3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量Diploid:100.00%DipG1:54.38%at46.90DipG2:15.91%at91.61DipS:29.71%G2/G1:1.95%CV:5.23DebrisAggregatesApoptosisDipG1DipG2DipSG0/G1SG2/MDNA检测的常用术语•表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。•通常由G0/G1峰的CV来反映【%CV=（SD/mean）x100】。•影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。1.变异系数（CoefficientofVariation，CV）•DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。•DI为1意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。•倍体（Ploidy）：原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。•二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。•DI为1.9-2.1的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。2.DNA指数（DNAindex，DI）和倍体（Ploidy）DNA检测的常用术语结果分析•CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手工进行参数统计和计算；•推荐使用ModFit分析软件（分析如下：）•1、打开软件；•2、在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细胞，必要时可以设两个门。•3、在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图•注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。ModFit分析ModFit分析ModFit分析ModFit分析ModFit分析ModFit分析Fileanalyzed:qq.003Dateanalyzed:3-Jun-2009Model:1DA0A_DSFAnalysistype:ManualanalysisDiploid:100.00%DipG1:63.02%at44.61DipG2:18.55%at86.71DipS:18.44%G2/G1:1.94%CV:6.12TotalS-Phase:18.44%TotalB.A.D.:5.45%Apoptosis:15.11%Mean:19.05Debris:6.04%Aggregates:1.72%Modeledevents:2775Allcycleevents:2166Cycleeventsperchannel:50RCS:6.238ModFit分析DebrisAggregatesDipG1DipG2DipSAn1G1An1G2An1SModFit分析【重要参数】DI（DNA指数,判断倍体数）=（标本G0/G1期细胞峰的平均荧光道数）/（正常二倍体细胞G0/G1期细胞峰的平均荧光道数）PI(增殖指数,表示细胞的增殖活性)（%）＝（S+G2M）/（G0/G1+S+G2M）×100%SPF(S期细胞比率,表示细胞的增殖活性)（%）=S/（G0/G1+S+G2M）×100%【倍体和细胞周期分析】发现DNA异倍体(二倍体峰DI1.1或0.9；四倍体峰DI2.1或1.9)，诊断为肿瘤或癌前病变；如无明显异倍体，但有一个突出的4倍体细胞峰和15%的S期细胞，并伴有G0/G1峰的CV9%，提示为肿瘤或增生旺盛的病变；如无明显异倍体，但G0/G1峰的CV增大，并伴有10%~15%的S期细胞和一个突出的4倍体峰，诊断为可疑肿瘤或增生旺盛的病变。•发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断•在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用•在指导肿瘤化疗中的作用【临床意义】乳腺癌DNA异倍体患者生存率乳腺癌肿瘤细胞异倍体患者长期生存率显著下降【临床病例】Diploid:46.75%DipG1:97.54%at46.06DipG2:0.58%at92.12DipS:1.88%G2/G1:2.00%CV:2.26Aneuploid1:47.55%An1G1:93.05%at49.83An1G2:0.00%at99.67An1S:6.95%G2/G1:2.00%CV:2.13DI:1.08Aneuploid2:5.70%An2G1:94.97%at55.72An2G2:5.03%at103.44An2S:0.00%G2/G1:1.86%CV:4.52DI:1.21AL骨髓Diploid:64.50%DipG1:92.45%at49.24DipG2:2.30%at98.48DipS:5.26%G2/G1:2.00%CV:3.21Aneuploid1:35.50%An1G1:97.69%at58.53An1G2:0.00%at123.89An1S:2.31%G2/G1:2.12%CV:3.14DI:1.19TotalAneuploidS-Phase:2.31%TotalS-Phase:4.21%TotalB.A.D.:0.35%Debris:1.14%Aggregates:0.00%Modeledevents:3567Allcycleevents:3526Cycleeventsperchannel:47RCS:2.356MM骨髓宫颈脱落细胞Diploid:97.61%DipG1:97.74%at49.78DipG2:0.02%at99.57DipS:2.25%G2/G1:2.00%CV:6.49Aneuploid1:2.39%An1G1:84.90%at75.79An1G2:15.10%at109.99An1S:0.00%G2/G1:1.45%CV:3.66DI:1.52肺癌胸水Diploid:100.00%DipG1:55.08%at46.83DipG2:15.67%at92.69DipS:29.25%G2/G1:1.98%CV:7.02增殖旺盛的肿瘤细胞株