临床微生物学检验第五版第14章分枝杆菌

第14章分枝杆菌、放线菌与诺卡菌概述•分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates）•分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fastbacillus）•放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系•放线菌是多数不致病，对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。•前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。•后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。概述放线菌与诺卡菌的区别特征放线菌诺卡菌培养特性厌氧或微需氧需氧菌35～37℃生长20～25℃不生长20～25℃或37℃均生长抗酸性非抗酸性丝状菌弱抗酸性分布寄生口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道存在外界环境如土壤多为腐生菌感染性内源性感染外源性感染代表菌种衣氏放线菌、龋齿放线菌牛型放线菌星形诺卡菌、巴西诺卡菌结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）•简称结核杆菌•人和动物结核病的病原菌第一节结核分枝杆菌•MTB包括人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）牛分枝杆菌（M.bovis）非洲分枝杆菌（M.africanum）坎纳分枝杆菌（M.canettii）田鼠分枝杆菌(M.microti)等•前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高一、分类二、临床意义•大约1/3的人口已感染MTB•有2000万活动性结核病患者•每年新发病900万人，死于结核病300万人•近年来，AIDS的发病率上升，AIDS患者又极易患结核病，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题•WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手二、临床意义二、临床意义(一)所致疾病通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见(二)免疫性有菌免疫或称传染性免疫细胞免疫迟发型超敏反应二、临床意义(三)变异•结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异•卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株•现已广泛用于人类结核病的防治二、临床意义(四)耐药性•对常见抗菌药物天然耐药•多重耐药结核病(multiple-drugresistancetuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡率很高三、微生物学检验（一）基本特性•结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭性酶•致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免疫损伤有关•结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质三、微生物学检验（二）标本采集•据感染部位的不同采集不同的标本•疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检•疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本）•采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检•其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养三、微生物学检验（三）标本直接检查1.形态学检查（1）直接涂片染色镜检（2）浓缩集菌涂片检查法2.核酸检测形态学检查•齐-尼染色（Ziehl-Neelsentechnique）是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色形态学检查•用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色涂片镜检的报告方式半定量报告石炭酸复红染色：抗酸杆菌（1000×）荧光染色：抗酸杆菌（450×）未找到抗酸菌可疑抗酸杆菌；再送标本检测01～2/300视野01～2/70视野1＋1～9/100视野2～18/50视野2＋1～9/10视野4～36/10视野3＋1～9/视野4～36/视野4＋9/视野36/视野•用PCR法快速诊断MTB感染•PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高•PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果核酸检测三、微生物学检验（四）分离培养与鉴定1.培养特性–专性需氧–3％～5％CO2能促进其生长–营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。常用罗氏培养基–最适生长温度为35～37℃，最适pH6.5～6.8–14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落–典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样2.分离培养•标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长)•37℃，5％～10％CO2培养8周•结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落•涂片染色为抗酸阳性Bactec–TB960快速培养系统3D-120型三、微生物学检验（四）分离培养与鉴定3.菌种鉴定(1)生化反应（2）噬菌体鉴定法（3）分子生物法菌种鉴定(4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸生化反应--烦琐、费时（4～8周）,影响因素多•结核分枝杆菌不发酵糖类•能产生触酶•人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能•人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象噬菌体鉴定法（PhaB）•Wilson等于1997年建立的快速检测新技术•原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活,已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖,并将菌体裂解,释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞,并将其裂解,在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。分子生物法菌种鉴定•PCR限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）•PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP）•核酸探针•核酸序列分析•多重PCR高效液相色谱（HPLC）•检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。三、微生物学检验（五）免疫学诊断1．结核菌素试验2．结核分枝杆菌抗原检测3.结核分枝杆菌抗体检测4.全血干扰素测定法结核菌素试验•针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白•原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。结核分枝杆菌抗原检测•用ELISA方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原(externalsecretedspecificantigen)浓度。•任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。结核抗体•作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一•比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。•近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38KDa和16KDa蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。全血干扰素测定法•原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。•2004年，Quantiferon-TBGoldassay问世，应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检测。•近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。•结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。（六）药物敏感性试验•将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。•经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。三、微生物检验第二节非结核分枝杆菌一、概述与分类二、临床意义三、微生物学检验一、概述与分类非结核分枝杆菌（ＮontuberculosisMycobactericum，NTM）:指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。•NTM种类众多，现已被鉴定的有150余种,包括专性寄生菌、腐生菌和中间型。•国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）分为三类，即缓慢生长菌、快速生长菌和不能培养菌三种类型。•Runyon按细菌产色素和生长速度将临床重要分枝杆菌分为RunyonⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群概述Runyon分类法Ⅰ群———光产色菌,如猿猴分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌;Ⅱ群———暗产色菌,如苏加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌;Ⅲ群———不产色菌,如鸟分枝杆菌复合群(M1aviumcomplex,MAC)、玛尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、嗜血分枝杆菌;Ⅳ群———快生长菌,如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。二、临床意义•迄今为止已发现NTM有150余种，其中约1/3与人类疾病有关。条件致病菌毒力低于结核分枝杆菌自然界中广泛存在可以在人体某些部位定植•结核病和NTM感染的治疗不同为何要关注NTM？自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶，可导致免疫力低下的患者感染。近年来，因手术器械、注射器具及医疗用水等灭菌不合格、使用不规范造成患者手术切口、注射部位NTM感染暴发事件。如：广东省某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件。该事件是由于手术器械灭菌不合格导致的手术切口感染，病原菌为快速生长型分枝杆菌。警钟长鸣——NTM潜在杀手？卫生部关于严重医院感染事件通报—1.关于深圳市某医院发生严重医院感染事件的通报2.卫生部关于安徽省某立医院恶性医疗损害事件的通报3.关于西安交通大学医学院某医院发生严重医院感染事件的通报4.关于山西省太原某中心医院血液透析感染事件的通报5.关于天津市蓟县某院新生儿医院感染事件的通报6.卫生部关于安徽省某县医院血液透析患者感染丙肝事件的通报7.关于广东省汕头市潮阳区某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件的通报———摘自江苏省卫生厅《严重医院感染事件通报与处罚规定选编》（2010年7月）光产色分枝杆菌（RunyonⅠ群）•堪萨斯分枝杆菌（M.kansaii）：能引起肺内和肺外类似结核样的病变•海分枝杆菌(M.marinum)：存在于淡水或海水。除可引起冷血动物（如鱼）感染外，亦能引起人的感染。通过皮肤微小创口侵入皮肤而引起所谓的“游泳池肉芽肿”。渔业工人可经受损皮肤遭受感染•猿分枝杆菌（M.simiae）：首先从猿分离到此菌，形态同结核分枝杆菌，可感染人类暗产色分枝杆菌（RunyonⅡ群）•瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum）：可引起人的淋巴结炎或肺部感染。•斯氏分枝杆菌(M.szulgai)：可引起成人肺部的慢性感染。不产色分枝杆菌（RunyonⅢ群）•鸟-胞内分枝杆菌复合体(M.avium-intracellularecomplex,MACorMAIC)：鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌有许多相似之处，故合起来称之为MAC。近年来发现HIV感染和AIDS患者易感染MAC。•溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）：对人可通过创伤局部感染，常在四肢伸侧形成无痛性溃疡，叫做Buruli溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。•蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）：是蟾蜍肉芽肿的病原菌，对人则多引起老年男性的慢性肺部感染。快速生长分枝杆菌（RunyonⅣ群）•⑴偶发分枝杆菌（M.fortuitum）：可引起人的局部感染或肺部感染，对现有的抗结核药物均耐药。•⑵龟分枝杆菌（M.chelonei）：该菌在引起免疫