临床微生物学检验第五版第8章肠杆菌科

第8章肠杆菌科肠杆菌科（Enterobactericaeae）概述•是栖居在人和动物的肠道内的一大群形态、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。•广泛分布在自然界中，包括植物、土壤、水以及人和动物的肠道中，多数是正常人肠道菌群的重要成员，在机体的其他部位相对较少。肠杆菌科（Enterobactericaeae）•包括致病性较强、能引起人类传染病的菌属：鼠疫耶尔森菌、伤寒沙门菌•引起人类腹泻和肠道感染的菌属（四个）•埃希菌属•志贺菌属•沙门菌属•耶尔森菌属与医院感染有关的条件致病菌•枸橼酸杆菌属•克雷伯菌属•肠杆菌属•泛菌属•沙雷菌属•变形杆菌属•普罗威登菌属•摩根菌属正常菌群与条件致病菌•有许多细菌既是肠道的正常菌群，也是条件致病菌。•在一定的条件下，能引起机会感染或二重感染。•1）机体抵抗力下降•2）寄居部位的改变•3）肠道菌群失调•约40种以上肠杆菌科菌种可以在临床标本中出现。大肠埃希菌•埃希菌属（Escherichia）包括5个种。•1.大肠埃希菌（E．coli）是最常见的临床分离菌，也是肠道中革兰阴性杆菌的主要成员，常引起各种肠内外的感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌，又分为正常（Normal）和不活泼（Inactive）2个亚种。•2.蟑螂埃希菌（E．blattae）不常见，偶可从人类标本中检出并有潜在的致病性。•3.弗格森埃希菌（E．fergusonii）•4.赫尔曼埃希菌（E．hermannii）•5.伤口埃希菌（E.vulneris）。•本菌属细菌的DNAG＋C为48～52mol％。本节以大肠埃希菌为代表叙述。一、临床意义（一）致病因素1．侵袭力本菌的K抗原和菌毛与侵袭力有关。K抗原：能抗吞噬，并能够抵抗抗体和补体的作用。菌毛：能帮助细菌黏附于黏膜表面，使细菌在肠道内定殖，产生毒素而引起相应症状。有侵袭力的菌株能直接侵犯肠道黏膜上皮引起炎症。2．内毒素大肠埃希菌的细胞壁有内毒素活性，其毒性部位在类脂A（lipidA），与所有革兰阴性杆菌产生的内毒素一样，具有相似的病理生理作用，如发热、休克、DIC等。3．肠毒素不耐热肠毒素（heatlabiletoxin，LT），加热65℃、30分钟即被破坏；耐热肠毒素（heatstabletoxin，ST）LT和ST均可使肠道细胞中cAMP的水平升高，引起肠液大量分泌而导致腹泻。所致疾病•肠道外感染泌尿道感染（最常见）胆道感染、腹膜炎、肺炎菌血症、新生儿脑膜炎•肠道感染ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAEC引起肠道感染的大肠埃希菌的主要致病特征菌株致病机制感染类型主要临床表现发病年龄危险因素ETECLT和ST腹泻，旅行者腹泻大量水样便，腹痛、恶心、脱水成人、儿童海外旅行EPEC黏附因子急性腹泻水样便、发热、呕吐、黏液便＜2岁婴儿、成人EIEC侵入结肠黏膜上皮志贺样脓血便脓血便，便中含红、白细胞和黏液，发热、腹痛成人海外旅行EHEC类志贺毒素腹泻、出血性肠炎腹泻（无WBC），腹痛、血便、发热、HUS儿童、老人未熟牛肉牛奶EAEC未明急、慢性腹泻水泻、呕吐所有年龄二、细菌特性•形态特征•培养特性•生化反应•抗原结构大肠埃希菌革兰染色形态特征大肠埃希菌电镜图返回培养特性•兼性厌氧，营养要求不高•在普通营养琼脂上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落大肠埃希菌菌落特征（血平板）培养特性•在血琼脂上某些菌株可产生β-溶血，大肠埃希菌菌落特征（MAC）返回在肠道选择培养基上可发酵乳糖，形成有色菌落。生化反应•发酵多种糖产酸产气，•吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐（IMVC）等4个试验的结果为＋＋――，•在克氏铁琼脂（KIA）上斜面和底层均产酸、产气，H2S阴性（AA＋―），•在动力、吲哚、脲酶（MIU）培养基上的反应结果为＋＋―，大肠埃希菌抗原结构返回•1．O抗原是多糖磷脂复合物（LPS），耐热，加热100℃不能灭活，目前已知有171种，是血清学分型的基础。•2．H抗原是不耐热的蛋白质，已知有56种，均为单相菌株。•3．K抗原是多糖荚膜抗原，对热稳定，在K抗原存在时能阻止O凝集。已知有100种，不是每个菌株均有K抗原。•大肠埃希菌的血清型别按O：K：H的顺序，以数字表示，如O111：K58：H2、O157：H7等。（一）检验程序（二）标本采集（三）检验方法（四）耐药性（五）结果分析与报告三、微生物学检验大肠埃希菌检验程序1）ETEC：生化反应加血清分型加肠毒素测定•生化反应符合大肠埃希菌，属于一些特定的血清型别；•主要依赖ST和LT肠毒素的检测，常用生物学方法或细胞培养、免疫学和分子生物学方法。2）EPEC：生化反应加血清分型，•用多价抗血清检测其O抗原。取5～10个乳糖阳性的大肠埃希菌菌落，进行特异性抗血清的凝集试验，3）EIEC：生化反应加血清分型加毒素测定，•本菌与志贺菌相似，多数EIEC为动力阴性，乳糖不发酵或迟缓发酵。•所有EIEC菌落均为赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，其中最常见的血清型O152和O124为乳糖阴性，与志贺菌的抗血清有交叉反应，两菌属十分相似，•主要的鉴别试验：醋酸钠、葡萄糖铵利用试验和粘质酸盐产酸试验，大肠埃希菌三者均阳性，而志贺菌三者均阴性。•毒力测定（豚鼠眼结膜试验）：以被检菌液接种于豚鼠眼结膜囊内，产生典型的角膜结膜炎症状，并在角膜上皮细胞内出现大量细菌者，为毒力试验阳性。4）EHEC：血清分型加生化反应•可用山梨醇麦康凯琼脂（SMAC）直接筛选不发酵山梨醇的菌落（35～37℃培养24～48h后选无色菌落），经次代培养后可用胶乳凝集试验检测O157抗原。O157:H7菌落特征（山梨醇麦康凯琼脂平板）返回沙门菌属一、分类二、细菌特性三、临床意义四、微生物学检验一、分类二、细菌特性•形态特征•培养特性•生化反应•抗原结构•变异性•抵抗力伤寒沙门菌革兰染色（一）形态特征革兰阴性直杆菌，较细长，大小0.7～1.5μm×2.0～5.0μm，多具有周鞭毛，能运动，有时会出现无鞭毛的突变型。无芽孢，无荚膜。伤寒沙门菌菌落特征（血平板）（二）培养特性兼性厌氧，最适生长温度35～37℃，最适生长pH为6.8～7.8。本菌属对营养的要求不高，在普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落，有时可出现粗糙型的菌落。伤寒沙门菌菌落特征（MAC）在肠道选择性培养基上菌落小至中等，透明或半透明，乳糖不发酵，与志贺菌的菌落相似伤寒沙门菌菌落特征（SS）有些能产生硫化氢的菌株，在SS琼脂上形成中心黑色的菌落。伤寒沙门菌KIA（KA－＋）MIU（＋－－）（三）生化反应乳糖阴性、在三糖铁琼脂中表现为产碱/产酸或产碱/产酸产气，H2S阳性、脲酶阴性沙门菌IMViC试验（－＋－－）吲哚阴性、动力阳性、VP阴性、枸橼酸盐阴性、鸟氨酸阳性。凡临床分离菌乳糖阳性、吲哚阳性或脲酶阳性者均不考虑为沙门菌。（四）抗原结构•主要有3种，即菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原及表面抗原（Vi抗原等）。•1．O抗原为多糖－类脂－蛋白质复合物，具耐热性，能耐受100℃2.5h。O抗原共有58种，以阿拉伯数字顺序排列，现已排至第67，但其中有9种被删除，故数字是不连续的。每个沙门菌的血清型可含一种或数种O抗原。•凡含共同抗原成分的血清型归为一个群，每个群以O加上阿拉伯数字及括号中大写的26个英文字母（A～Z）顺序编排，如O2群（A），O4群（B），O50群（Z）等，Z以后无英文字母标记，直接以O加数字表示，如O51群～O67群。O抗原是分群的依据。•其刺激机体产生的抗体以IgM为主，与相应的抗血清反应时呈颗粒状凝集。所致疾病•伤寒和副伤寒•急性胃肠炎或食物中毒•菌血症（或败血症）肠热症•即指伤寒和副伤寒。最典型的是由伤寒沙门菌引起的伤寒，表现为发热、血培养或肥达反应阳性。•肠热症也可由其他沙门菌引起，常表现为轻度发热和腹泻。伤寒的发病过程•细菌随污染的食品或水经口感染，穿过小肠上皮进入黏膜下组织。细菌在此被吞噬细胞吞噬，但吞噬后不被消灭反在吞噬细胞内繁殖，并随吞噬细胞经淋巴管到达淋巴结。•在淋巴结内大量繁殖后，经胸导管进入血流（第一次菌血症）。此时黏膜在临床上出现发热、不适等症状。•随后，细菌随血流播散至肝、脾、胆囊、肾和骨髓等实质器官中，继续大量繁殖，再次进入血流（第二次菌血症）并随血液扩散至全身各器官及皮肤，患者出现持续高热、肝脾肿大、皮疹和全身（内毒素）中毒症状。•胆囊中的细菌随胆汁进入肠腔，可经粪便排出，肾脏中的细菌随尿排出体外。•本病潜伏期7～20天，典型病程3～4周，发病2周后机体出现免疫反应，通过特异性抗体和致敏淋巴细胞消灭细菌，使疾病好转，但同时也可引起迟发性变态反应，导致肠壁孤立和集合淋巴结的坏死和溃疡，甚至造成肠穿孔而危及生命。•携带者：伤寒沙门菌感染过后约3％患者可成为携带者，在粪便中可持续排菌长达1年或1年以上。（一）检验程序（二）标本采集（三）检验方法四、微生物学检验沙门菌检验程序、标本采集•根据疾病的类型、病情和病程的不同分别采集不同的标本。•伤寒沙门菌分离培养原则上于发病第1周取血，第2、3周取粪便做培养的分离率高，第3周也可取尿液培养，全病程均可作骨髓培养。•血清学诊断应在病程的不同时期分别采集2～3份标本。鉴定•挑选疑为沙门菌的可疑菌落（EMB上无色或不透明琥珀色；MAC上较小、无色透明；SS上不透明或透明、无色或中央为黑色的菌落；XLD上呈红色或中央为黑色的菌落）。将可疑菌落进一步鉴定到属和种（生化、血清学试验）。沙门菌血清学鉴定抗体检测（肥达反应）•用已知伤寒、副伤寒沙门菌的O、H抗原，检测受检血清中有无相应的抗体的半定量凝集试验，称为肥达反应（Widaltest）。•与细菌分离培养同时进行或在前者失败的情况下，能辅助诊断伤寒、副伤寒A、B和C引起的肠热症。330株沙门菌属对常用抗菌药物的耐药率013.855.86.58.412.914.719.4020406080100耐药率(%)亚胺培南头孢哌酮/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦氨苄西林/舒巴坦头孢曲松环丙沙星左氧沙星头孢吡肟头孢呋辛头孢唑啉志贺菌属一、分类二、细菌特性三、临床意义四、微生物学检验一、分类志贺菌属分为A、B、C、D4群：A群为痢疾志贺菌（S.dysenteriae），B群为福氏志贺菌（S.flexneri），C群为鲍氏志贺菌（S.boydii），D群为宋内志贺菌（S.sonnei）。二、细菌特性•形态特征•培养特性•生化反应•抗原结构•变异性•抵抗力志贺菌革兰染色（一）形态结构革兰阴性杆菌，菌体短小，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。志贺菌菌落特征(MAC)（二）培养特性•兼性厌氧，最适生长温度为37℃，最适pH为7.2～7.4。•对营养的要求不高，能在普通培养基上生长。•在肠道鉴别培养基上形成乳糖不发酵、中等大小、无色半透明的菌落，宋内志贺菌常形成粗糙型菌落。（四）抗原结构•无H抗原，有O抗原，部分菌种有K抗原。•O抗原是分类的依据，有群特异性和型特异性两种抗原，根据生化反应和O抗原的不同，将志贺菌属分为4个血清群（A、B、C、D）和40余个血清型。O抗原耐热，加热100℃、60min不被破坏。•K抗原存在时能阻断O抗原与相应抗血清的凝集作用。加热100℃、60min可消除K抗原对O抗原的阻断作用。（六）抵抗力•本属细菌对理化因素的抵抗力较其他肠杆菌科细菌为低。•在1％石炭酸中15～30min和加热60℃10min即被杀死，对酸较敏感，在运送时须使用含有缓冲剂的培养基。致病物质所致疾病三、临床意义所致疾病志贺菌属引起细菌性痢疾，主要有以下3种临床类型：•急性细菌性痢疾•慢性菌痢•带菌者（一）检验程序（二）标本采集（三）检验方法四、微生物学检验志贺菌检验程序标本采集•在抗生素使用前采集新鲜粪便中脓、血、黏液部分，床边接种或立即送检，不能及时接种者可用卡-布运送培养基送检，昏迷不能排便患者可用肛拭取样。275株志贺菌属对常用抗菌药物的耐药率1.82.916.318.619.422.234.557.159.571.9020406080100耐药率(%)亚胺培南头孢哌酮/舒巴坦哌拉