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第三章生物敏感元件的固定化3.1概述固定化的主要目的是将酶等生物敏感元件限制在一定的空间,但又不妨碍被分析物的自由扩散.与游离相生物材料相比,固相生物材料具有一系列优点:1)热稳定性提高2)可重复使用3)不需要在反应后进行催化物质与反应物质的分离4)可以根据已知的半衰期(half-life)确定传感器膜的寿命等.3.2基本方法夹心法(sandwich)或隔离法(insulation)包埋法(entrapment)吸附法(adsorption)共价结合法(covalentbinding)交联法(crosslinking)微胶囊法(micro-encapsulation)夹心法吸附法共价结合法交联法微胶囊法凝胶包埋法3.2.1交心法将生物活性材料封闭在双层滤膜之间,形象地称为夹心法.依生物材料的不同而选择各种孔径的滤膜.特点:操作简单不需要化学处理固定生物量大响应速度快重现性好适用于微生物和组织膜制作3.2.2吸附法经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物敏感元件固定,称为吸附法.吸附的作用力:氢键范德华力离子键配位键吸附的牢固程度与溶液的pH、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及吸附物的浓度有关。3.2.3凝胶包埋法将生物分子包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中即为包埋法。不产生化学修饰保持生物分子活性膜的孔径和几何形状可任意控制被包埋物不易渗漏分子可以在膜中扩散分子量大的分子在膜中扩散困难3.2.4共价键合法使生物活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法。载体包括无机载体和有机载体。酶与载体共价键合方式:与载体直接反应连接通过同源双功能试剂与载体连接通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应连接选择那种方法,要了解酶的氨基酸残基的反应性(reactivity)、出现频率(frequencyofoccurrence)和可接近性(accessibility)。反应性指氨基酸残基的反应活性,即氨基酸残基参与共价反应的活泼程度。具有反应能力的氨基酸残基称为反应性氨基酸。反应性氨基酸常常含有容易对羰基发生亲核攻击的基团,如氨基、巯基和羟基。它们的亲核反应速率又受到基团的亲核性、碱性以及碳阳离子的亲电性等因素的影响。可接近性是指是否能够抵达到蛋白质中的氨基酸残基所在的位置,它与氨基酸残基的梳水性有关。一般而言,疏水性氨基酸多分布在球蛋白分子表面,它们在水环境中能够起到维持蛋白质三维空间结构的作用。在酶的共价固定中,尤其是要保护活性中心.有两种方法:1)共价反应前用酶的底物或是底物的类似物等将活性中心保护起来。2)利用共价反应的化学选择性和生物特异性异源双功能试剂。酶与载体之间的共价结合方式,主要有重氮法、肽键法、烷化法等。如图所示:OCH3NOHN++酶OCH3NOHN酶NH酶OOCNH+OOHCNH酶NHOOCN酶OOHCNH酶OOCNH2酶NNCCNClCl+OCNNCCNClN酶H重氮法肽键法烷化法共价结合的特点结合牢固、蛋白质分子不易脱落、载体不易降解、寿命长操作步骤多、酶活性受影响,所以制备具有高活性的固定化酶比较困难。3.2.5交联法此法借助双功能试剂(bifunctionalagents)使蛋白质结合到惰性载体或蛋白质分子彼此交联成网状结构.操作简单、结合牢固、在酶源较困难时常常需要加入数倍于酶的惰性蛋白质作为基质。严格控制pH,交联剂浓度也比较重要3-5双功能试剂戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定量的酶,抗体和戊二醛同加入溶液中,在一定温度下反应一段时间,然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。在正常情况下,蛋白质只与一个戊二醛分子的一个醛基反应,而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应,即不发生聚合,故可将戊二醛先与蛋白质反应,透析除去未反应的戊二醛,再加入抗体,这样就不会产生聚合现象,此为二部交联法。SchematicillustrationofthehypotheticalstructureofamultilayerofGOxand2-AFdepositedontheAuelectrode.(2-aminoethy1)ferrocene-NH2与-COOH的交联反应-SH与maleimide3.2.6微胶囊法微胶囊法主要采用脂质体(liposome)来包埋生物活性材料或指示分子。脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭合囊泡.质肢体的两个重要参数:俘获容积:一定量脂质做包封的容积,单位是L/mol.包裹效率:脂双层所包裹的水室所占的比例.脂质体磷脂双层分子膜a)脂质体微胶囊膜结构脂质体微胶囊包埋指示分子加入脂溶性物质脂溶性物质嵌入脂质体膜膜遭到破坏,释放指示分子,给出信号b)脂质体技术用于生物传感器原理图3-3脂质体微胶囊技术固定生物活性材料•溶胶-凝胶法的化学过程是首先将原料分散在溶液中,然后经过水解反应生成活性单体,活性单体进行聚合,开始成为溶胶,进而生成具有一定结构的凝胶,最后经过干燥和热处理得纳米粒子,即经由分子态→聚合体→溶胶→凝胶→晶态(或非晶态)的过程。由于这种方法在材料制备初期就在相当小的尺寸范围内进行控制,其均匀性可达到亚微米级、纳米级甚至分子级的水平,因而近些年来越来越受到人们的青睐。3.2.7溶胶-凝胶玻璃(sol-gelglass)溶胶-凝胶前体+水+催化剂+溶剂溶胶形成薄膜水解聚缩合凝胶干凝胶气凝胶蒸发干燥超临界干燥图3-4溶胶-凝胶的一般过程Sol-Gel”referstoaprocessbywhichlargelyinorganicpolymersaresynthesized.A“Sol”isadispersionofcolloidalparticlesanda“Gel”isaninterconnectedpolymericnetworkformedbytheassemblyofthesol.3.3LB膜技术生物传感器的响应速度和响应活性是一对相互影响的因素.固定量增大响应活性增高膜厚度增加,响应速度减慢Langmuir-Blodgeett(LB)膜LB膜的原理:许多生物分子在洁净的水表面展开后能形成水不溶性液态单分子膜,小心压缩表面积使液态膜逐渐过度到成为一个分子厚度的似固态膜,这种膜以技术的发明者命名,称为LB膜.LB膜实验对液体的纯度、pH和温度有很高的要求LB膜优点可以制的很薄的膜,厚度和层数可控,可获得高密度酶分子膜LB膜制备:是由铺膜、推膜、挂膜三个基本操作构成。样品溶解在铺展溶剂中,铺展溶剂须要满足的的条件:对成膜材料溶解性好,易铺展,挥发速度适中,密度相对较低,纯度高和化学惰性。基片常用的有玻璃、石英、铝蒸镀膜等。基片表面应光滑,并避免油脂类污染。a)表面的单分子膜b)第一次抽出基片c)第二次插入基片d)第二次抽出插片图3-6典型LB膜的沉积过程3.4光平版印刷技术(Lightlithographic)光平版印刷术简称光刻(photoetching),利用照相原理与化学腐蚀相结合,在工件表面制取精密、细微和复杂薄层图形,广泛用于印刷电路和集成电路的制造以及印刷制版等过程.原理利用光刻胶(photoresist)感光后因光化学反应而固化的特点将掩模板(mask)上的图形刻制到被加工表面上.光刻胶是一类对光敏感的高分子溶液,由感光树脂、增感剂和溶剂组成.光刻胶经过光照射后,其理化性质(特别是溶解性和亲和性)发生明显变化,经适当溶剂处理,溶去可溶性部分,得到所需要的图像.负性胶:光照射后形成不可溶物质正性胶:光照射后变成可溶物质掩膜光聚合基片基片基片除掉未聚合的光刻胶及酶膜图3-7光致酶膜定位沉积基片基片涂酶层基片涂酶层紫外线照射灭活酶活性酶图3-8固定化酶的局部灭活法3.5固定化生物活性材料的性质生物分子被固定后,性质会发生变化.酶变化的原因是:1)载体与环境物质之间的静电作用和疏水作用使得酶周围环境中反应物质或氢离子非均匀分布;2)增加了底物和产物的扩散限制,它们的传质速率也发生变化;3)酶分子构型发生变化,与之结合的载体对酶活动有一定空间障碍.3.5.1固定化酶的稳定性酶的稳定性描述1)在低温和常温条件下长期保存的稳定性2)在较高温度条件下的稳定性3)固定化酶长期工作的稳定性含有疏水基团的载体可能减少酶在保存过程中的自然失活一定条件下,由于静电作用,亲水性载体可能增加酶的稳定性或降低酶的稳定性如果酶与载体结合后高级结构被稳定下来且酶的活性中心结构变化不大,酶的稳定性会增加.固定化对酶作用方式和专一性也有影响.载体基质的孔径和底物的大小以及酶的固定化方式决定了底物扩散进入载体基质和抵达酶活性中心的可能性,酶的作用有时仅仅局限与部分底物分子,在极端的情况下,甚至连酶的专一性也会发生改变.空间和扩散限制只发生在酶对大分子的作用TheimmobilizationofcytcinMPSwasachievedaccordingtothefollowingprocedure.First,a20mMcytcstocksolutionwaspreparedbydissolving0.067gofcytcin270mlof0.05MKH2PO4–NaOHbuffersolution(pH7.5)withstirring.Then,0.15gofmodifiedMPSwasaddedto30mlofthestocksolutionwithstirringat4Cfor3h.TheMPS-cytcsolidswerecollectedbyfiltrationanddriedundervacuum.Schematicviewofthestepsleadingfromasolutiont0amesoporousoxidenetwork.Adv.Mater.2003,15,1933Adv.Mater.2003,15,19333.5.2固定化酶的动力学常数底物所携带的电荷与载体所带的电荷相反,底物就会在载体周围富集,反之,底物浓度就会在固定化酶的微环境中下降.底物扩散也是影响酶促反应的因素之一,分两个方面:1)固相载体对底物扩散的阻碍作用,成为外部扩散限制(externaldiffusionlimitation)2)底物在载体内部扩散时因载体孔径大小不同遇到的阻碍作用,成为内部扩散限制(internaldiffusionlimitation)当酶促反应速率远低于底物扩散速率并且底物浓度足够大时,酶促反应呈一级动力学,实验所测得的动力学参数为真实值。如果在酶附近的底物浓度很低,酶促反应速率将受控于底物扩散的限制。需要实验数据求得固定化酶的真实动力学常数。第四章电化学生物传感器之一:经典酶电极4.1概述酶电极经典酶电极第一代生物传感器介体酶电极第二代生物传感器直接电化学生物传感器第三代生物传感器电极过程由固定化生物膜和基础电极完成电极过程由化学介体分子介导酶分子被直接修饰在电极表面4.2基础电极4.2.1离子选择电极离子选择电极(Ionselectiveelectrode)是对特定离子产生选择性响应的一类电化学传感器,其主要结构如图:引出导线电极帽塑料内管电极壳内参比电极内充液敏感膜膜电位包括膜内的扩散电位和相界面电位,其值通过完整的电化学电池的电动势的测量来推算,电池表示如下:电极A溶液1膜溶液2电极B电极电位电极电位膜电位如果溶液1中含有被选择的离子,其活度应与膜电位在一定的范围内线性相关,遵循Nernst方程:E=E0(RT/zF)lnα或E=E0(2.303RT/zF)lnαE为离子选择性电极的电位;E0为电位常数项;R为气体常数;F为法拉第常数;为要测量离子的活度;z为离子的价数;T为绝对温度;2.303RT/zF为Nernst斜率,是温度的函数。电极类型测定底物电极类型测定底物玻璃膜电极H+,Na+,Ag+,Li+,K+等晶膜电极F-,Cl-,Br-,S2-,CN-离子交换液膜电极Cu2+,Cl-Mg2+,NO3-,等气敏膜电极CO2,NH2,H2S,SO2,HCN等中性载体电极K+,Li
本文标题:生物传感器-2
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