生物化学实验内容

《生物化学》实验教学大纲课程类别：专业基础适用专业：本科临床学专业课程总学时：实验学时：32实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程开课实验室名称：生化实验室一、目的和任务生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。二、基本要求1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。三、考试方法及成绩评定方法占总成绩之比总分分数分配考核目的要求30%30移液管正确使用方法10考察学生平时对移液管的使用是否正确与熟练程度移液枪的正确使用方法10考察学生平时对移液枪的使用情况是否正确与熟练程度紫外分光光度计的正确使用方法10考察学生平时对紫外分光光度计的使用情况是否正确与熟练程度四、说明实验教材及参考书：1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010参考资料：1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011五、实验项目数据表序号实验名称学时类别要求类型设备套数每组人数每组常规仪器设备名称，数量每组主要消耗材料名称、数量、消耗额1蛋白质的沉淀反应3201310人水浴锅1台试管2支、滤纸3张2影响酶活性的因素3201310人水浴锅1台试管5支3血清醋酸纤维素薄膜电泳6202125人电泳仪1台电泳槽1台薄膜条1张干4血清胆固醇的测定3201125人分光光度计1台试管3支5转氨基作用6201125人烘干箱1台层析缸1个层析滤纸1张6血清尿素氮的测定3201125人分光光度计1台试管2支、移液管4支7动物组织基因组DNA的提取6202125人分光光度计1台EP管6支、移液枪3支8实验基本操作考核2203125人分光光度计1台试管1支、移液枪1支、移液管1支[注]1）类别：2：指为技术（或专业基础）课开设的教学实验项目。2）要求：0：必修1选修3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。六、各实验项目教学大纲实验一蛋白质的沉淀反应【预习要求】预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。【实验目的】1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。【实验内容】（一）蛋白质的盐折1.原理大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。2.操作步骤①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。②另取1小试管置于试管架上，插入准备好的滤纸和漏斗。将操作“1”之混合液倾入漏斗内过滤。观察结果。③向操作“2”的滤液中逐步加入米粒大小固体(NH4)2SO4,边加边摇匀，直至饱和为止。观察结果。再向管内加入少量蒸馏水，观察结果有何变化。④将操作“2”的滤液漏斗置于1支小试管上，用玻棒戳穿滤纸尖部，加少量蒸馏水将滤纸上的沉淀粉洗入试管内，摇匀后观察和解释结果。（二）重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质1.原理重金属粒子如Pb2+、Cu2＋、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属于生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。2.操作步骤①编号2支小试管，各加5％鸡蛋清溶液20滴。②向试管1加入0.1mol/LNaoH溶液1滴，混匀。加入3％CuSO4溶液4滴，混匀。③向试管2加入5％三氯乙酸溶液10滴，混匀。④记录结果。（三）乙醇沉淀蛋白质1.原理某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等，能破坏蛋白质的水化膜，降低其在溶液中的稳定性。当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时，蛋白质胶粒上的电荷被中和。加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。反应在0—4℃下进行，并应立即分离沉淀物，否则蛋白质会变性。2.操作步骤a)编号2支小试管，各加5％鸡蛋清溶液10滴。b)每管内均加入95％乙醇20滴，边加边混匀，静置片刻后观察结果。c)向试管1内加入饱和NaCl溶液1—2滴，观察结果。（四）、加热沉淀蛋白质1、原理：几乎所有的蛋白质都可因加热而凝固，这是由于温度升高，则容易出现沉淀。在酸性、碱性条件下，蛋白质则易变性，此时若温度升高，虽变性并不出现沉淀，在冷却后加酸或加碱调节PH值达蛋白质的等电点时，则有沉淀析出。2、操作：1）取试管4支，编号，按下表操作管号试剂（滴）12345%蛋白质溶液202020201%醋酸＿1＿＿10%醋酸＿＿10＿10%NaOH＿＿＿102）将上述试管同时放入沸水浴中加热，观察并记录各试管出现的现象，解释变化原因。3）取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴入10%氢氧化钠溶液并观察现象。4）向第4管中慢慢滴入10%的醋酸溶液并观察现象。【教学方法】1.课堂讲授2.指导学生操作3.课堂提问4.课外实验报告作业【复习思考题】1.什么因素可导致蛋白质的沉淀作用？举例说明。2.蛋白质的沉淀有几种？试举例说明。3.蛋白质的沉淀与变性之间有何关系？蛋白质在发生沉淀和变性后，其性质发生哪些变化？实验二影响酶活性的因素【预习要求】预习各小实验的具体实验原理和操作内容【实验目的】验证酶的特异性，观察影响酶促反应的一些因素，加深对酶性质的认识。【实验内容】1）、实验原理淀粉酶能催化淀粉水解，生成的麦芽糖属于还原性糖，能使班氏试剂中二价铜离子还原成一价亚铜，生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，所以不能产生具有还原性的葡萄糖和果糖，蔗糖本身又无还原性，故不与班氏试剂产生颜色反应。唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解，生成大小不同的糊精及最后水解成麦芽糖。淀粉及糊精遇碘各呈不同的颜色反应。直链淀粉遇碘呈蓝色，糊精按分子的大小遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色。最小的糊精和麦芽糖遇碘不显色。根据颜色反应，可以了解淀粉水解的程度。由于在不同的温度、不同的酸碱度下唾液淀粉酶活性高低不同，所以淀粉水解的程度也不同。因此，通过与碘产生的颜色反应判断淀粉水解的程度，来了解温度、pH、和激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。2）、实验操作1、稀释唾液的配制将痰吐尽，用水漱口，再含蒸馏水做咀嚼运动，2分钟后吐入烧杯中，再用滤纸过滤后待用。2、酶的特异性实验取2支试管标号后按下表加入试剂。试剂管号缓冲液（pH6.8）淀粉溶液（1%）蔗糖溶液（1%）稀释唾液120滴10滴-5滴220滴-10滴5滴各管混匀后，放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，放入沸水中煮沸，观察结果。3、温度对酶促反应的影响（1）取三支试管，编号，每管加入pH6.8缓冲液20滴。1%淀粉溶液10滴。（2）将第一支试管放入37℃恒温水浴，第二支试管放入沸水浴，第三支试管放入冰浴。（3）放置5分钟后，分别向各试管中加入稀释唾液5滴，再放回原处。（4）10分钟后，分别向各试管中加入碘液1滴，观察三支试管中颜色的区别，说明温度对酶促反应的影响。4、pH对酶促反应的影响(1)取3支试管,编号后按下表加入各种试剂。pH5.0缓冲液pH6.8缓冲液pH8.0缓冲液淀粉溶液1%稀释唾液120滴--10滴5滴2-20滴-10滴5滴3--20滴10滴5滴（2）将上面三支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。（3）取出试管，分别加入1滴碘液，观察三支试管颜色的区别，说明pH对酶促反应的影响。5、激活剂和抑制剂的影响取4支试管，编号，按照下表加入试剂。将上面4支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。取出分别滴加碘液2～3滴，摇匀，观察现象，说明原因。【教学方法】1.课堂讲授2.指导学生操作试剂1%淀粉溶液（滴）1%NaCl（滴）1%硫酸铜（滴）1%硫酸钠（滴）蒸馏水（滴）稀释唾液（滴）1202---10220-2--10320--2-10420---210试剂管号管号3.课堂提问4.课外实验报告作业【复习思考题】1、影响酶活性的因素有哪些，举例说明。2、酶的特异性分了几大类，我们实验当中验证的是哪一类？3、何为激活剂？何为抑制剂？实验三血清醋酸纤维素薄膜电泳【预习要求】预习实验原理和各步操作【实验目的】1、掌握血清蛋白质电泳的基本原理和基本操作过程。2、熟悉血清蛋白质醋纤维素薄膜电泳图谱的含义及临床意义。【实验内容】一、实验原理带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。带电颗粒(球形分子)在电场中的电泳速度(V)，从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度(V)与颗粒带电荷量(Q)以及电场强度(E)成正比，与球形分子的大小(半径为r)及所在介质的粘度(η)成反比。因此,在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（moverate,M）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；反之越慢。但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。二、实验操作1、点样将醋酸纤维薄膜(2.5cm×8cm)一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端2.0cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸(或纱布)贴紧，加盖，平衡2～3min，然后通电。2、通电一般电压用110～140V，电流约0.4～0.6mA／cm，时间45～60min。3、染色关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染2～3min，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。4、定量取试管6支，编号依次为0（空白）、A、α1、α2、β、γ，将电泳图谱亦按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约α1带的空白带放入空白管中。各管中加0.4mol/LNaOH4ml，振摇数次，使染料色泽浸出，30min后，在620nm波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。5、计算吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和：T=A+α1+α2+β+γ。分别按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：清蛋白(%)＝(A/T)×100%α1球蛋白(%)＝(α1/T)×100%α2球蛋白(%)＝(α2/T)×100%β球蛋白(%)＝(β/T)×100%γ球蛋白(%)＝(γ/T)×100%现在许多实验室采用光密度计定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透明液中约5～10min，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后成为透明的膜