大豆制品脲酶活性测定

大豆制品中尿素酶（脲酶）活性的测定晁洪雨2016.4.8一、测定的原因：生大豆含有多种能被热破坏的抗营养因子（如抗胰蛋白酶）。大豆中脲酶的含量与抗胰蛋白酶成正相关，且能很快、很经济地予以测定。所以，测定脲酶的活性（UA），就可以预测大豆饼粕的加工程度是否适当及营养品质的优劣。二、影响大豆制品脲酶活性的因素：•①大豆加热过程中的温度；•②大豆原料最初的水分含量；•③大豆粒度的大小；•④加热时所用压力的大小；•⑤大豆加热时间的长短。高温、高湿、高压，粒度小，时间长脲酶活性低。但是，加工过度，一些氨基酸会被破坏。所以脲酶活性过高（豆制品过生）或过低（豆制品过熟）都表明豆制品质量较差。三、测定原理：脲酶活性测定实际上是在一定条件下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试样、每分钟分解尿素所产生的氨的量。脲酶NH2CONH2→→2NH3↑+CO2•四、测定方法：（一）定性法：1、酚红法（1）原理：酚红指示剂在pH6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。（2）仪器和试剂：•粉碎机：粉碎时不产生强烈发热•分析天平：感量0.01g•25ml纳式比色管•恒温水浴锅•0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml95%乙醇溶液•结晶尿素：分析纯（3）方法：粉碎→称取0.05±0.001g→放入试管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变红时间→5min后取出试管，摇匀继续观察空白试验：不加尿素，其他同上。品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。（4）注意事项：•1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；•2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；•3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。2、尿素酚红法（1）原理：酚红指示剂在pH6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。（2）仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取14.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml1.0N硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）（3）方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。（4）注意事项：•1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不可太细，否则不容易观察；•2.样品一定要铺平，容易观察；•3.溶液保质期为3个月，最好1个月内用完；•4.此方法容易受颗粒度影响。（二）定量法1、pH增值法（1）原理：脲酶水解尿素产生氨，使溶液的pH值升高，通过测定样品溶液的pH值和空白的pH值之差来计算脲酶的活性。脲酶活性定义为：在30℃和pH=7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后所释放的氨态氮的毫升数。（2）仪器与器皿酸度计（pH计）：具有玻璃电极、甘汞电极恒温水浴：须能保持温度30±0.5℃试管：20×150mm并配有橡皮塞（50mL）（3）试剂磷酸缓冲液0.05mol/L：称取3.403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。再称取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸馏水中，合并两者并配成1000mL，用强酸或强碱调节pH=7.0。尿素缓冲液：称取15g尿素，溶于500mL磷酸缓冲液中，调节pH=7.0。样品粉碎：至少60%通过400微米试验筛。（4）操作步骤准确称取0.400±0.00lg样品2份，分别置于2支试管中。一支试管加入20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一支加入20mL尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇匀一次。取出立即在流水中冷却，5min内测定溶液pH值。（5）计算UA=pH(B管)-pH(A管)2、滴定法（1）原理：将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min后，尿素酶催化尿素水解产生氨，用过量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。（2）脲酶活性定义在30℃和pH＝7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素后，所释放的氨态氮的毫克数。(3)仪器与设备样品筛：孔径200μm酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置恒温水浴：可控温30±0.5℃试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子精密计时器粉碎机：粉碎时应不生强热（如球磨机）分析天平：感量0.1mg移液管：10m1（4）试剂尿素：分折纯。磷酸氢二钠：分析纯。磷酸二氢钾：分析纯。尿素缓冲液（pH6.9至7.0）：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶于此缓冲溶液中，盐酸：分析纯，0.1mol/L溶液氢氧化钠：分析纯，0.1mol/L标推溶液，按GB601-77《标准溶液制备方法》的规定配制。（5）操作方法称取0.2g试样→转入试管→加入10mL尿素缓冲液→立即盖塞、剧烈摇动→马上置于30±0.5℃恒温水浴→准确计时30min→加入10mL0.1mol/L盐酸→迅速冷却到20℃→内容物全都转入烧杯→立即用氢氧化钠标淮溶液滴定到pH4.70。空白试管→加入10mL尿素缓冲液→加入10mL0.1mol/L盐酸→称取0.2g试样加入试管→立即盖塞、剧烈摇动→马上置于30±0.5℃恒温水浴→准确计时30min→迅速冷却到20℃→内容物全都转入烧杯→立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4.70。（6）计算结果UA=14×C(V0-V)/(30×m)C—氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）V0—空白试验消耗氢氧化钠溶液体积（mL）V—测定试样消耗氢氧化钠溶液体积（mL）m—试样质量（g）若干试样经粉碎前的预干燥处理时，则其计算如下：UA=14×C(V0-V)×(1-S)/(30×m)S—预干燥时试样失重的百分率饲料用的大豆粕尿素酶活性不能超过0.4