生物工程下游技术-毛忠贵版--自考-06705-课件第12章-色谱分离技术

第十二章色谱分离第一节概述色谱分离也称为色层分离或层析分离，在分析检测中则常称为色谱分析。它是一种物理的分离方法。原理：利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中；当多组分混合物随流动相流动时、由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。其中固定的称为固定相；流过固定相的称为流动相。第一节概述色谱分离的基本特点：(1)分离效率高(2)应用范围广色谱分离的应用范围极广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物。尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的。(3)高灵敏度的在线检测：与其他分离方法相比，色谱分离具有高灵敏度在线检测的特性。(4)快速分析：高效细颗粒层析剂和高压液相色谱分离技术的采用，保证了在高分离效率前提下的高分离速率，从而可以提高单位时间的产量。(5)过程自动化操作：(6)不能放大，操作成本高，一般只适合于高附加值产品的制备：第二节色谱分离的分类一、按分离机理不同分类：（溶质与固定相相互作用的机理）(一)吸附色谱分离：由于固定相对不同物质吸附力不同而使混合物分离的方法。(二)分配色谱：又称为液液色谱，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其操作方法分两种：1、柱（纸或板）色谱分离法：固定相是将与流动互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；2、逆流分配法：其固定相和流动相都放在一组特别的分配管中。一、按分离机理不同分类(三)离子交换色谱：树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。(四)凝胶色谱：以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱。(五)亲和色谱：把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。1、柱色谱分离在柱中进行的色谱分离。优点：进样量大，回收容易。2、纸上色谱分离以滤纸为载体的分配色谱。优点：设备简单，操作方便，分离效率高，所需样品量少。3、薄层色谱分离将固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行的色谱分离。优点：操作简便，分离效率高，分离速率快，适用广。二、按固定相形状不同分类三、其他分类方法1、根据流动相的物态不同，可分为：气相色谱分离，液相色谱分离，超临界色谱分离。2、根据操作压力不同，可分为：低压色谱分离（0.5MPa），中压色谱分离（0.5-5MPa），高压色谱分离（5-50MPa）。3、根据洗脱操作时展开方式不同，可分为：洗脱展开法，前沿分析法，置换展开法。第三节生物工业中的色谱分离一、色谱分离的规模色谱分析：10mg；半制备：10-50mg；制备：1.0-10g；工业生产：20g/d。二、色谱分离方法的选择1、目的产物的分子结构，物理化学特性，分子量的大小；2、分子结构，理化特性，大小与目的产物相近的杂质的成分和含量。3、目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。三、分析色谱与制备色谱及工业色谱的比较1、应用色谱技术范围的不同：制备和工业色谱主要是采用以液相为流动相的柱上色谱。2、操作上的不同：制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好，色谱柱也应适当大些。3、色谱分离理论上的不同：①理论塔板数的不同；②分配系数的不同；③样品保留值与峰高的不同。第四节色谱分离的基本原理若各组分对固定相的亲和力大小不同，因而各组分在固定相流动相中分布也不同，而导致各组分随流动相的移动速率就不同，使各组分在色谱柱内分层而得以分离，这就是色谱分离的基础。一、分配色谱分配色谱原理分配色谱是利用附着在层析剂表面的溶剂作为固定相，洗脱剂为流动相，不同物质在两相间的分配系数不同，迁移速率不同而实现对混合物的分离。分配色谱由载体、附着在载体表面的固定相、流动相构成；载体：惰性物质，优先吸附固定相而对溶质无吸附能力。二、吸附色谱（一）吸附：溶液中的溶质在固体表面富集的过程（二）吸附平衡：溶液中的溶质被吸附剂表面俘获的同时，一部分被吸附的溶质会脱离吸附剂回到溶液，即解吸附，当吸附的速率与解吸附速率达到相等时，吸附剂上的溶质量不再改变即为吸附平衡。（三）吸附等温线：在一定温度下，达到吸附平衡时，单位质量的吸附剂所吸附的溶质量仅与溶液浓度有关，吸附量与溶液浓度的关系称为吸附等温线。Langmuir吸附等温线：当很小时，则因此，吸附色谱与分配色谱一样为线性色谱，其分配系数为a，塔板理论同分配色谱完全一样BBAacc)(BBbcacBAc1)(Bc11BbcBc)(BAc三、凝胶色谱三、凝胶色谱凝胶色谱所用的层析剂是一类无吸附能力的多孔凝胶颗粒，多孔颗粒孔隙内的溶液为固定相，颗粒间隙中的溶液为固定相，由于不同分子大小不同而在颗粒内外分布不同，因此洗脱速度不同而实现对分子大小不同的混合物分离。第五节柱色谱分离法工业规模的色谱分离大多采用柱色谱分离法。一、层析剂用于色谱分离技术中的团定相或分离介质，总称为层析剂。它由基质和表面活性官能团(或活动中心)组成。生物产品所需团定相或层析剂应具备下列特性：(1)不溶于流动相，且具有较好的化学稳定性和机械强度；(2)具有较大的表面积和孔隙度．且粒度、孔径分布均匀；(3)有较高的回收率和负载量，能达到所需的分离效率，且重现性好；(4)有些分离过程，层析剂使用前后需要高压消毒．此时层析剂应具有较好的热稳定性；(5)无毒性，分离过程不引起目的产物的变性或失活；(6)成本较低，价格合理。层析剂种类层析剂的种类很多。按化合物的种类可分成：无机基质层析剂和有机基质层析剂两大类；按色谱分离机理可分成：吸附、分配、离子交换、凝胶和亲和层析剂五类；按形状可分成：球形和无定形两类；按硬度可分成：硬质层析剂、半硬质凝胶层析剂及生物软胶，如琼脂糖；按结构可分成：表面多孔薄层层析剂和完全多孔层析剂两类。常用层析剂：无机：硅胶，氧化铝，活性炭，多孔玻璃，羟基磷灰石；有机：琼脂糖，葡聚糖，纤维素，聚丙烯酰胺凝胶，聚乙烯醇。二、装置1、进样及流动相供给装置；2、色谱柱；3、检测器与流分收集器。三、操作技术(一)样品溶解与进样方法：采用色谱方法分离和纯化生物大分子物质时，制备合适的样品溶液是成败的关键之一。样品中应不夹带固体颗粒，包括沉淀和菌体碎片等。(二)展开操作：1．洗脱展开法2．前沿分析法3．置换展开法第六节亲和色谱亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点：具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。一、基本原理亲和色谱也属于一种吸附色谱，但它的吸附作用主要靠生物分子对它的互补结合体(配基)的生物识别能力。生物活性物质的专一性是由分子中有关作用基团（官能团）的化学结构与它们的空间排列决定。例如，酶和底物的专一性结合。一、基本原理亲和色谱的基本过程：把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。目的物质被吸附，杂质直接流出。变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；②抗体：抗原、病毒、细胞；③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；⑥细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素。二、亲和层析剂制备过程：1、载体的选择；2、载体的活化；3、配基的连接。理想载体的特性：1、不溶性；2、渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过；3、高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状；4、最低的吸附力；5、较好的化学稳定性；6、抗微生物和酶的侵蚀；7、亲水性；8、具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。（一）琼脂糖；（二）硅胶；（三）合成高分子。三、亲和色谱操作中的洗脱方法在亲和色谱洗脱操作中，洗脱方法有两类，即普通洗脱法和专一性洗脱法。普通洗脱法：与其他色谱分离方法一样，可以通过改变溶剂或缓冲液的类型，改变缓冲液的pH和离子强度，改变洗脱温度，以及添加促溶剂等措施进行洗脱。专一性洗脱法：是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基，同时对生物活性物质产生竞争性的结合，从而达到洗脱的目的。一般说来，专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。但是，专一性洗脱剂的价格都比较昂贵，所以常与普通洗脱条件配合作用。