cDNA合成

研究用CodeNo.2641A说明书ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）v201301Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●酶贮存溶液1●起源1●活性定义1●纯度1●用途1●添附Buffer组成2●1st-StrandcDNA合成的实验操作方法2●使用λRNA进行RT-PCR反应的实验例3●使用HL60TotalRNA进行HumanTFR基因（4.4kb）的RT-PCR反应的实验例4●使用本制品进行2StepRealTimeRT-PCR反应的实验例6●制品说明本制品是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNaseH-的M-MLV反转录酶。一般的野生型M-MLV（MoloneyMurineLeukemiaVirus）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNaseH活性。由于RNaseH能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶M-MLV（RNaseH-）的RNaseH活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。●制品内容RTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）10,000Units5×M-MLVBuffer1ml●保存：-20℃。●酶贮存溶液Tris-HCl（pH7.5）20mMNaCl200mMEDTA0.1mMDTT1.0mMGlycerol（V/V）50%NonidetP-400.01%●起源：PurifiedfromanE.colistrainexpressingarecombinantenzyme.●活性定义以Poly（rA）•Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1nmol的[3H]dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。●纯度：1.200U的本酶和1μg的λDNA-HindIII在37℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。2.200U的本酶和1μg的SupercoiledpBR322DNA在37℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。3.200U的本酶和1μg的16S，23SrRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳谱带不发生变化。●用途：1.1st-StrandcDNA的合成。2.cDNAProbe的制备。3.RT-PCR反应以及RealTimeRT-PCR反应。-1-●添附Buffer组成（保存：-20℃）5×M-MLVBufferTris-HCl（pH8.3）250mMKCl375mMMgCl215mMDTT50mM●1st-StrandcDNA合成的实验操作方法1.Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl。*TotalRNA的使用量一般为1ng～1μg；mRNA的使用量一般为10pg～1μg。2.70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。3.离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。4.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。试剂名称使用量上述模板RNA/引物变性溶液6μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（各10mM）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlRTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.25μl～1μl*RNasefreedH2Oupto10μl*当起始模板RNA量＞500ng时，RTaseM-MLV（RNaseH-）的使用量应＞0.25μl。5.42℃保温1小时*。*以RandomPrimers作为反转录引物时应先进行30℃，10分钟反应，然后再在42℃条件保温1小时。6.70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-StrandcDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用1μl～5μl。-2-试剂名称使用量模板RNA1ng～1μg*Oligo(dT)12-18Primer（50μM）或RandomPrimers（25μM）或SpecificPrimer（10μM）1μlRNasefreedH2Oupto6μl●使用λRNA进行RT-PCR反应的实验例本实验中使用的λRNA为带有Poly(A)的λDNA的转录产物。本实验中分别扩增了1kb、3kb、5kb、8kb和10kb的目的DNA片段。1.反转录反应①在Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液。②70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。③离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。④在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。⑤42℃保温1小时。⑥70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。2.PCR反应①按下列组成配制PCR反应液，全量50μl。-3-试剂名称使用量λRNA（100ng/μl）1μlOligo(dT)18Primer（50μM）1μlRNasefreedH2O5μlTotalVolume7μl试剂名称使用量上述模板RNA/引物变性溶液7μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（各10mM）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlRTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.25μlTotalVolume10μl试剂名称使用量上述cDNA溶液2μldNTPMixture（各2.5mM）8μlForwardPrimer（10μM）1μlReversePrimer（10μM）1μl10×LAPCRBufferII（Mg2＋Plus）5μlTaKaRaLATaq（5U/μl）0.5μldH2O32.5μlTotalVolume50μl②PCR反应条件如下：1kb、3kb的PCR反应条件5kb、8kb、10kb的PCR反应条件94℃，1min94℃，1min94℃，30sec98℃，20sec55℃，30sec68℃，10min72℃，3min72℃，10min72℃，10min3.RT-PCR扩增结果PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如下。●使用HL60TotalRNA进行HumanTFR基因（4.4kb）的RT-PCR反应的实验例1.反转录反应①在Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液。②70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。③离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。④在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。-4-试剂名称使用量HL60TotalRNA（100ng/μl）1μlOligo(dT)18Primer（50μM）1μlRNasefreedH2O5μlTotalVolume7μl试剂名称使用量上述模板RNA/引物变性溶液7μl5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture（各10mM）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.25μlRTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）0.25μlTotalVolume10μl30CyclesM12345M30CyclesM:1kbDNALadder(DyePlus)（CodeNo.3426）1:1kb的PCR扩增结果2:3kb的PCR扩增结果3:5kb的PCR扩增结果4:8kb的PCR扩增结果5:10kb的PCR扩增结果⑤42℃保温1小时。⑥70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。2.PCR反应①按下列组成配制PCR反应液，全量50μl。②PCR反应条件如下：94℃，1min94℃，30sec55℃，30sec72℃，5min72℃，10min3.RT-PCR扩增结果PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如下。-5-试剂名称使用量上述cDNA溶液分别取1、2、5μldNTPMixture（各2.5mM）8μlForwardPrimer（10μM）1μlReversePrimer（10μM）1μl10×LAPCRBufferII（Mg2＋Plus）5μlTaKaRaLATaq（5U/μl）0.5μldH2Oupto50μlM123M30CyclesM:1kbDNALadder(DyePlus)（CodeNo.3426）1:1μlcDNA溶液扩增结果2:2μlcDNA溶液扩增结果3:5μlcDNA溶液扩增结果●使用本制品进行2StepRealTimeRT-PCR反应的实验例本实验以MouseLiverTotalRNA为模板，使用2StepRealTimeRT-PCR方法，扩增MouseGAPDH基因。实验时，首先以MouseLiverTotalRNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA溶液使用EASYDilution按10倍梯度稀释，再将相当于1pg～100ngTotalRNA量的cDNA作为模板，进行RealTimePCR扩增（使用了SYBRGreenI嵌合荧光法），制作标准曲线。具体实验过程如下：1.反转录反应以MouseLiverTotalRNA为模板进行反转录反应。①按下列组成配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。*1反转录引物可使用以下三种引物，使用量分别如下：Random6mers（100μM）0.5μl（50pmol）OligodTPrimer（50μM）0.5μl（25pmol）SpecificPrimer（2μM）0.5μl（1pmol）*2反应体积可按需求相应放大，10μl的反应体系中TotalRNA的最大使用量为500ng。②反转录反应条件如下：42℃10min（反转录反应）95℃2min（反转录酶的失活反应）2.RealTimePCR反应Target：MouseGAPDH。Template：MouseLiverTotalRNA经反转录反应后的cDNA溶液。使用EASYDilution（CodeNo.9160）将cDNA溶液按100，101，102，103，104，105倍梯度稀释（10倍梯度稀释）后，各取2μl进行RealTimePCR反应。此时25μlPCR反应液中的cDNA添加量分别相当于从100ng，10ng，1ng，100pg，10pg，1pg的TotalRNA反转录得到的cDNA量。NegativeControl的模板使用了灭菌蒸馏水。扩增长度：108bp。使用仪器：SmartCyclerSystem。检测方法：SYBRGreenI嵌合荧光法。-6-试剂名称使用量5×M-MLVBuffer2μldNTPMixture(各10mM)0.5μlRandom6mers(各100μM)*10.5μlRTaseM-MLV(RNaseH-)(200U/μl)0.25μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.25μlTotalRNA500ngRNasefreedH2Oupto10μlTotalVolume10μl*2①按下列组成配制RealTimePCR反应液（反应液请在冰上配制）。PCR反应使用了SYBRPremixExTaq（PerfectRealTime）。②将上述PCR反应液加入至RealTimePCR用反应管中，然后再加入2μl*的上述各cDNA的梯度稀释液。*RT反应液(即各cDNA的梯度稀释液)的加入量不要超过RealTimePCR反应总体积的1/10（V/V）量。③进行RealTimePCR反应，PCR反应条件如下：95℃10sec1Cycle95℃5sec60℃20sec④RealTimePCR反应结果。RealTimePCR扩增曲线图及融解曲线图如下：扩增曲线图融解曲线图-7-试剂名称使用量SYBRPremixExTaq(2×)12.5μlPCRForwardPrimer（10μM）0.5μlPCRReversePrimer（10μM）0.5μldH2O(灭菌蒸