生物化学检验实验室基本知识

1第二章生物化学检验实验室基本知识掌握好临床实验室的基本知识，包括实验用纯水，实验室常用器材、试剂、试剂盒，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质，方法学评价试验，临床诊断性能评价等，才可能保证检测结果的准确度与精密度，能够促进实验室与临床的沟通，因此其对于从事生物化学检验的实验室工作者非常重要。第一节实验用纯水实验用纯水指天然水和自来水经过蒸馏、离子交换、活性炭吸附、超滤等处理后除去了杂质的水。其质量的高低直接影响到检测结果的准确度和精密度。一、实验室用水等级1985年美国国家临床实验室标准委员会（nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards，NCCLS）将实验用水分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级（表2-1）。中国国家技术监督局先后于1992年、2000年批准实施的《中国国家验室用水标准》（GB6682-92、GB6682-2000），也将分析实验用水分为三个等级（表2-2），两次的区别主要是电导率的计量单位不同。表2-1美国NCCLS等级纯水的规定及用途(1985)级别Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级pH未定未定5.0～8.0电阻率(MΩ·cm,25℃,最大量)102.01.0硅(mgSiO2/L,最大量)0.050.11.0微生物含量（每毫升最大菌落数）10103未定硅（mgSiO2/L，最大量）0.050.11.0微粒0.2µm微孔膜过滤未定未定有机物质活性碳过滤未定未定用途原子吸收，火焰光度，荧光，电解质，酶，高效层析，电泳，一般实验室检验，器皿冲洗。器皿洗涤，要求不高的定性学习目标掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验方法与参考物质的分级，五种方法学评价试验的目的、原理、操作、计算及注意事项。熟悉化学试剂的选择、保存与配制，常用临床实验室器材的使用及玻璃仪器的清洗，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质的相关基本概念，实验方法的正确选择，诊断试验的性能评价。了解实验用纯水。2参比液，缓冲液。试验。表2-2中国国家验室用水GB6682-2002标准名称一级二级三级pH范围(25℃)－（未定）－5.0～7.5电导率（25℃）ms/m≤0.010.100.50比电阻（25℃，MΩ·cm）≥1010.2可氧化物质（以O计）mg/L＜－0.080.40吸光度（254nm，1cm光程）≤0.0010.01－蒸发残渣（105±25℃）mg/L≤－1.02.0可溶性硅（以SiO2计）mg/L＜0.010.02－可见，Ⅰ级（一级）水最好。临床实验室一般选用Ⅱ级（二级）水即可。水越纯，所含离子就越少，则电阻越大，导电性越差，即电阻率（比电阻）越大，电导率越小。同时，水越纯，所含的SiO2、细菌数、有机物等越少。二、纯水的制备方法（一）蒸馏法自来水(或天然水)在蒸馏器中进行加热气化，水蒸气经冷凝后得到蒸馏水（distiledwater，DW）。蒸馏水的电阻率约为0.1MΩ·cm（25℃）。(二)离子交换法将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂质离子，称为离子交换法。离子交换法制备去离子水（deionizedwater，DW）的原理是水中的杂质离子先通过扩散进入树脂颗粒的内部，然后水中的Na+、Ca2+等与阳离子交换树脂中的活性基团H+发生交换，水中的Cl-、SO42-等则与阴离子交换树脂中的活性基团OH-发生交换。由于树脂为多孔网状结构，具有非常强的吸附能力，可以同时除去颗粒杂质。去离子水的电阻率约为5.0MΩ·cm（25℃）以上。蒸馏水与去离子水的英文缩写均为DW。因蒸馏水里面有挥发性物质、有离子干扰，故临床实验室多用去离子水，或先蒸馏、后去离子的纯水。(三)其他方法在制备纯水时，还可采用超滤膜法（除细菌等），活性炭吸附法（除有机物）等，以及采用活性炭吸附法、去离子树脂、超滤膜法等步骤的混合纯化系统。与自动生化分析仪配套的纯水机一般采用混合纯化系统，要求其纯水电阻率大于2.0MΩ·cm（25℃）。3三、水的纯度检查水的纯度检查首先测定电阻率或电导率，然后检测残留物含量。1.电阻率利用电导仪或兆欧表测定。电导仪测得的电导率可与电阻率换算：电导的单位是西门子(S)，电导(S)与电阻(Ω)互为倒数。电导率为每cm长的电导(S/cm)，电导仪的表头读数单位为µS/cm，因此电导仪读数为1时，电阻率为1×106Ω·cm=1MΩ·cm。GB6682-2000规定的一级水电导率的最小值为0.01mS/m，即为0.01µS/mm=0.1µS/cm，正好与GB6682-92规定的一级水电导率的最小值0.1µS/cm相吻合。2.可溶性硅限量试验取纯水10ml，加入15滴1%的钼酸铵溶液，8滴草酸、硫酸混合液(按4%草酸1份加4mol/L硫酸3份的体积比)，混匀置室温10min，加5滴1%硫酸亚铁溶液，摇匀以不呈蓝色为合格(≤0.05mg/L)（以上百分比均为W/V）。3.细菌菌落计数按细菌常规菌落计数法进行检测。实际工作中，除了要保证实验用纯水的制备质量外，还应重视纯水的贮存、运输以及使用过程的规范化，避免一切可能的污染，防止纯水等级的下降。第二节常用临床实验室器材常用临床实验室器材包括普通的玻璃器材以及非玻璃器材。普通的玻璃器材又分为量器类和容器类。量器用于计量溶液体积，如量筒、容量瓶、刻度吸管等，不能作为反应容器，更不能加热。容器则是物质反应或贮存的器皿如试管、烧杯等。非玻璃器材包括微量加样器，一次性注射器、采血器、塑料试管，塑料吸管、试剂瓶、洗瓶等，以塑料类为主。一、微量加样器的使用微量加样器又称微量移液器、微量进样器。其下端为可装卸、可更换的尖管形移液嘴（吸头），上方是控制采样的推进按钮。常用的有固定式和可调式两种类型，规格有µl级、ml级。其准确度和精密度均高于有被替代趋势的刻度吸管。（一）工作原理微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负压吸入定量的液体，其吸液量由活塞在活塞套内移动的距离来确定，再按下按钮使活塞向下移动，排出活塞腔内的气体而将吸头内的液体排出。4（二）操作方法1.选择在移液范围内的加样器，若为可调式则先将容量调节到所需的容量上。2.将吸头套在加样器的下端，轻轻转动后牢固地套上，确保密封。3.正式使用前需连续按动数次（不吸液体），以保持腔内外气压一致。4.用手垂直握住加样器，拇指将按钮压至第一停点（第一档位），并将吸头浸入到液面下1～3mm，再缓慢地放松按钮使之复位，等待1～2s后从液体中取出时拖靠掉吸头外部残液于被取出的容器内壁中。注意避免吸头与其他任何东西碰撞。5.将吸头移到加样容器内壁上，轻轻地将按钮压至第一停点将液体排出，等待1～2s，再把按钮压至第二停点（第二档位），排尽全部液体后，吸头应沿容器壁向上滑动取出，此时拖靠吸头内部残液于加样容器内壁中。再放松按钮使之复位，卸下吸头，完成一次操作过程。（三）注意事项1.微量加样器属于精密量器，不能直接接触液体、异物，不用时应套上吸头保持管内的清洁，以免液体或杂质吸入导致阻塞。2.吸头与微量加样器下端的连接必须密封。3.对于可调式按钮上的标线应对准所需容量的刻度线。4.当加样器中有溶液时必须垂直放置，不允许倒放，否则久后失准。5.使用前应检查其准确度和精密度。二、常用玻璃器材的使用与清洗(一)常用玻璃器材的使用1.刻度吸管带有许多分刻度，用于准确量取刻度量以下的任意量溶液，又称为吸量管，简称吸管。在使用时应保证其干燥清洁，并可采用欲量取的液体润洗2～3次以保证所量取的液体浓度不变。量取溶液时用大拇指与中指握住吸管的上方，下端垂直插入溶液中1～2cm，另一只手用洗耳球头对准、贴紧吸管上端后将液体缓慢吸入管内。当液面上升到所需刻度以上时，立即用食指按住管口，并将吸管的下端提出液面靠在盛装溶液的器皿内壁上，略为放松食指使液体流出，当管内液体的弯5月面（凹月面）平稳下降到与刻度标线相切时，立即用食指压紧管口不让液体流出。在即将取出吸管时将其末端外部的液体拖靠在盛装溶液的器皿内壁上，然后将其垂直靠在承接溶液器皿的内壁上，使承接的器皿倾斜，松开食指让管内的溶液自然地沿器壁流下，到达所需量体积时等待10～15s，取出吸管。注意若管口上未标示“吹”字（一般1ml及其以上的吸量管不吹），残留在吸管末端内的溶液，不可采用外力使其流出；若管口上刻有“吹”字，则必须将末端的溶液吹出。使用吸管时应注意尽量避免采用管头自然流下后的残留量（欠准确）。比如用2.0ml吸管吸取1.5ml液体，应取满刻度2.0ml放至0.5ml间的液体（弯月面→弯月面），而不能先放走0.5ml、再取剩余量的1.5ml（弯月面→管头残留）。移液管在管的中间有一膨大部，在顶端细部标有容量刻度线，用于一次性移取较大量的的溶液。使用方法同上。2.容量瓶为一平底圆球状长颈瓶，具有磨口瓶塞，在使用中与磨口瓶塞配套使用。瓶颈上刻有一环形标线，表示在所指温度(一般为20℃)时的容积标线。主要用于将准确称量的物质配成准确浓度的溶液，或将准确容积及浓度的溶液稀释为准确容积及浓度的稀溶液。3.量筒用于量取体积不甚准确的液体。化学清洁的量筒应倒挂存放。(二)玻璃器材的清洗1.新购玻璃器材的清洗新购的玻璃器材都含有游离碱，可先用肥皂水或去污粉洗刷，自来水冲洗，然后浸泡在1%～2%的盐酸溶液中4h以上，再用流水冲洗，最后经蒸馏水冲洗2～3次，在100～130℃烘箱中烘干或晾干备用。2.使用过的玻璃器材的清洗对于容器类玻璃器材，先用自来水洗刷后，用肥皂水或去污粉刷洗，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水淋洗2～3次，倒置干燥备用。量器类玻璃器材，使用后应立即浸泡于凉水中,以防止物质的干相关链接20℃时，玻璃量器的刻度才与实际容量相吻合。温度改变时应进行校正，参见《全国临床检验操作规程》。常用容器类玻璃器材如试管、烧杯、烧瓶、漏斗、干燥器等的使用参见基础化学教材。6涸。然后用流水冲洗,待沥干后,用铬酸溶液浸泡数小时，再用流水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～4次，晾干备用。对于盛装过具有传染性样本的容器，应浸泡在杀菌剂如5%（V/V）煤酚皂溶液等中过夜消毒，再按上法清洗备用。3.清洁液的配制和使用当玻璃器皿不能用肥皂水或去污粉洗净时，可用清洁液浸泡。清洁液的配方有多种（表2-3），可根据需要选用。表2-3清洁液的配方配方ⅠⅡⅢⅣⅤ重铬酸钾（g）806050200100粗浓硫酸（ml）10090900500800水（ml）1000750100500200配制时，先将重铬酸钾溶于水中，可加热助溶，待冷。然后将粗浓硫酸缓缓加入上液中，边加边搅拌不可过快，以免产生的高热造成容器的破裂。切忌将重铬酸钾溶液向浓硫酸中倾倒。根据配制量的多少选择烧杯或陶瓷缸作为容器。由于清洁液的腐蚀性较强，用时切勿溅到皮肤和衣服上，同时由于它的吸水性较强，因而应加盖贮存。使用过程中若清洁液颜色变为绿色，提示效力降低，可加入适量的重铬酸钾和浓硫酸继续使用；若变为黑色则不能再用。另外还应注意清洁液适用于已经过清洗但未能洗净的玻璃器皿，对于未清洗、未消毒的器皿不要直接浸泡于清洁液中。第三节生物化学检验试剂概述生化检验实际工作中涉及到很多的检验试剂，包括常用化学试剂、试剂盒，其正确选择、保存与配制是实验室工作的基本要求。一、化学试剂的种类与保存（一）化学试剂的种类化学试剂有不同的等级规格，各自的纯度和用途也不尽相同，参照进口化学试剂的质量标准，我国将化学试剂（通用试剂）分为四个常用等级。1.一级优级纯（G.R）又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液。2.二级分析纯（A.R）又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析。3.三级化学纯（C.P），蓝色标签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性试验。74.四级实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低、但比工业用高，适用于一般定性实验。生化检验一般选择三级或三级以上的试剂，若需要准确的定量分析或配制校准溶液则必须选用二级以上的化学试剂。另外，还有光谱纯试剂（S.P）、层析纯试剂（ch.p）等，指用光谱法、层析法等测不出杂质含