发酵液预处理与浓缩

第八章微生物工程下游技术原料液中目标产物的浓度一般都很低，如L-异亮氨酸浓度为2.4％，青霉素为3.6％，庆大霉素为0.2％，胰岛素仅为0.001％。原料液中成分复杂，常存在与目标分子结构极其相似的分子及异构体。当生物技术产品是食品或药物时，溶剂的使用受到一定的限制，萃取、色谱等手段会受到一定的限制。发酵液成分一般不稳定。原料液特点发酵液放罐后，应及时快速操作，原因在于1.菌体可能自溶2.容易被杂菌污染3.引起产物的破坏和降解。原料液中常存在降解目标产物的杂质，如可水解目标蛋白质的蛋白酶。下游技术可分为4个阶段，即预处理、提取、精制、成品制作，如图所示。预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩调pH离心研磨法双水相吸附干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离结晶下游技术一般工艺过程预处理→细胞分离→细胞破壁加热过滤匀浆法调pH离心研磨法絮凝膜分离酶解法碎片分离→提取→精制→成品制作离心沉淀(重)结晶浓缩双水相吸附干燥膜分离萃取色谱分离无菌过滤超滤膜分离结晶原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第一节发酵液预处理1、降低黏度加水稀释：简单，增体积、降低产物浓度。加热升温：柠檬酸发酵，90℃，蛋白质变性凝固，利于过滤2、凝聚、絮凝改变粒子分散状态，形成大颗粒，利过滤凝聚与絮凝凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。凝聚和絮凝凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁盐类）作用下，使胶体体系不稳定并使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用高分子絮凝剂将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。常用絮凝剂聚丙烯酰胺类：用量少，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快，适用范围广。无机高分子聚合物天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。3、调整PH4、加入反应剂环丝氨酸发酵液，氯化钙、磷酸盐生成沉淀。高价无机离子的去除Ca2+草酸Mg2+三聚磷酸钠Fe3+黄血盐（普鲁士蓝）蛋白质去除加热调pH(草酸，无机酸或碱)蛋白质的变性最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。第二节过滤、细胞破碎、结晶过滤是在某一支撑物上放过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒留下，是固液分离的常用方法之一。助滤剂是一种具有特殊性能的细粉或纤维，它能使某些难以过滤的物料变得容易过滤常用的助滤剂：硅藻土、珍珠岩。一、过滤1.过滤设备的分类根据推动力的不同可分为四类（a）重力过滤自然过滤（b）加压过滤板框过滤（c）真空过滤真空过滤器（d）离心过滤离心过滤器2.过滤介质1、无定形颗粒：活性炭颗粒、沙、无烟煤2、成形颗粒：烧结金属、烧结塑料3、非金属织物：尼龙、玻璃纤维4、金属织物：不锈钢丝网5、无纺品：纸、石棉板框压滤机板框压滤机优点：结构简单、过滤面积大、操作压力高、适用广缺点：设备笨重、间歇操作、劳动强度大、辅助时间长陶瓷滤膜对于一些固体颗粒小、溶液粘度大的体系，过滤实际上是很难进行的，必须采用离心技术方能达到目的。二、离心操作方式：间歇式、连续式型式：管式、套筒离心沉降利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离高速冷冻离心机旋转过滤机滚筒式离心机4000细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内含物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型药物成分的基础。三、细胞破碎一些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组DNA产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使重组的药物成分释放出来，为后续的分离纯化做好准备工作。1.酶消化法细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的与细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。反应条件温和。此法的缺点在于酶的消耗限制了在大规模生产中的使用。2.机械法•匀浆法•研磨法•超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行细胞破碎，效率更高•高压均质法细胞破碎仪溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列.四、结晶1.结晶的特点（1）只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。（2）通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。（3）结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。2.结晶过程(1)过饱和溶液的形成(2)晶核生成(3)晶体的生长过饱和溶液的形成方法(1)冷却(2)溶剂蒸发(3)改变溶剂性质3.晶体的生长在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶核或晶种将长大，这种现象称为晶体生长。提高晶体质量的方法（1）晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状、纯度（2）影响晶体纯度的因素：母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布4.常用的工业起晶方法（1）自然起晶法：（2）晶种起晶法：5.重结晶经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有一定量的杂质。此时工业上常常需要采用重结晶的方式进行精制。重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体。重结晶的操作过程（1）选择合适的溶剂；（2）将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解；（3）冷却使之再次结晶；（4）分离母液；（5）洗涤分离实例——西地兰毛花毛地黄干燥叶粉70%乙醇热提三次醇提液减压浓缩至含乙醇20%，放冷胶状沉淀（叶绿素等杂质）稀醇液减压浓缩至无醇味浓水液氯仿洗涤氯仿液浓水液加乙醇至22%稀醇液水液氯仿液氯仿萃取三次氯仿液回收氯仿残留物少量CH3OH与水混合苷结晶甲醇-氯仿-水分配氯仿层(主要是苷A、B)水层浓缩结晶(苷B、C)甲醇-氯仿-水分配水层氯仿层(苷B)水层浓缩，过滤结晶(苷C)溶于乙醇，加Ca(OH)2减压浓缩，结晶结晶(苷C)甲醇重结晶西地兰纯品第三节膜分离Membraneseparation是利用特殊制造的、具有选择透过性能的膜，在外力推动下对混合物进行分离、提纯、浓缩的一种分离方法。3.1膜分离概述膜的定义：在一种流体相间有一薄层凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜膜还必须具有高度的渗透选择性膜分离的基础根据质量、体积和几何形态差异进行分离。如过滤（Fitration，F）、微滤（Microfiltration，MF）（0.02～10微米）和超滤（Ultrafiltration，UF）（0.001～0.02微米）。膜分离的特点①分离效能高。②膜分离过程都不发生相变，能耗低。③膜分离过程的工作温度在室温附近，膜分离设备本身没有运动的部件，结构紧凑、维修费用低，易于自动化。④设备体积小，占地少。⑤膜分离可直接插入已有的生产工艺流程。膜分离存在的问题①在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低；②膜的耐压性、耐热性、耐溶剂是有限的，故应用范围受限制；③仅采用膜分离技术分离效果有限，往往需要与其他分离工艺组合起来使用。按膜孔径大小分类微滤膜0.02～10µm超滤膜0.001～0.02µm（1～20nm）反渗透膜0.0001～0.001µm（0.1～1nm）纳米过滤膜平均直径2nm。3.2膜原理膜的性能参数孔道特征包括孔径（poresize）、孔径分布和孔隙度。孔径分布（poresizedistribution）是指膜中一定大小的孔的体积占整个孔体积的百分数。孔隙度（effectivenumberofpores）是指整个膜中孔所占的体积百分数。水通量：水通量为每单位时间内通过单位膜面积的水体积流量，也叫透水率，即水透过膜的速率。0.5µm0.5µm3µm20µm膜的电镜照片中空纤维超滤膜结构单内皮层双皮层单内皮层中空纤维超滤膜结构膜污染的处理与再生用物理方法清洗化学清洗方法①起溶解作用的物质：酸、碱、酶（蛋白酶）、螯合剂、表面活性剂、分散剂。②起切断离子结合作用的方法：改变离子强度、pH、电位。③起氧化作用的物质：过氧化氢、次氯酸盐。3.3膜组件的结构和特点管式膜组件tubularmembranemodule平板膜组件平板膜组件结构parallel-platemembranemodule螺旋卷式膜组件螺旋卷式膜组件结构spiral-woundmembranemodule3.4膜分离在生物工程中的的应用膜分离技术在生物工程中应用广泛各种膜分离法的原理和应用范围膜分离法传质推动力应用举例微滤压差0.05～0.5MPa除菌，回收菌超滤压差0.1～1.0MPa蛋白质、多糖的回收和浓缩反渗透压差1.0～10MPa盐、氨基酸、糖的浓缩浓缩大分子纯化去杂质（植物成分）去热源滤过除菌菌体分离对于发酵的胞外产物，首先要除去悬浮的微生物、离子与胶体。目前，较好的固液分离方法是过滤或离心。采用超滤法去除谷氨酸发酵液中的菌体，不仅可以将发酵原液中固形物含量浓缩10倍，为菌体的再利用创造了条件；而且超滤透过液中谷氨酸含量、pH等理化指标与发酵液相同，但不含菌体，且蛋白含量很低，再利用等电点法提取谷氨酸时，回收率可达到90.96%，比传统等电点法高7个百分点。小分子产物的回收氨基酸、抗生素、有机酸和动物疫苗等发酵产品的相对分子质量在2000以下，用超滤法可从发酵液中回收这些小分子产物，然后利用反渗透法进行浓缩和除去更小的杂质。除内毒素内毒素是细菌新陈代谢和细菌死后分解的产物，主要成分是脂多糖、脂蛋白等。在静脉注射药液时，如果将其带进血液，会对人体造成相当大的危害。传统的针剂用水除内毒素的方法是过滤加活性炭吸附，此法并不可靠。在医药工业上用超滤法制造无菌水。蛋白质的回收与脱盐根据蛋白质的相对分子质量，选择适当的超滤膜，可进行蛋白质的浓缩和脱盐。药酒和中药制剂的澄清渗透蒸发是液体混合物在膜的一侧与膜接触，其中易渗透组分较多地溶解在膜上，并扩散通过膜，在膜的另一侧气化而被抽出，从而得到分离的过程。渗透蒸发的过程原理第四节萃取分离基本概念萃取extraction是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。4.1溶剂萃取供提取的溶液称为料液；从料液中待提取的物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶剂称为萃取剂；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液称为萃取液；被萃取出溶质后的料液称萃余液。分配定律平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数K，即：K＝萃取液浓度/萃余液浓度＝cL／cR常温下K为常数，c的单位通常用mol/L。影响萃取效果的因素(1)pH值pH值直接影响分配系数，还可能对选择性有影响。如青霉素在pH2萃取时，乙酸丁酯萃取液中青霉烯酸可达青霉素含量的12.5％，而在pH3的条件下萃取，则可降低至4％。另外，pH值还应尽量选择