第十章动物基因工程

1第十章动物基因工程现代生物技术（生物工程）的概念建立在分子遗传学、生物化学、微生物学以及化学工程、计算技术等基础上的现代生物技术，是20世纪后半叶蓬勃发展起来的新技术领域，为人类保健、农牧业、食品工业、环境保护等提供了强大的发展动力。现代生物技术的内涵非常广泛并不断发展，目前主要有：基因工程·细胞工程·蛋白质工程·酶工程·糖工程·环境生物工程·转基因动物·克隆动物·基因治疗·生物制药·生物信息学·高级生物传感器2第一节基因工程概述一、重组DNA技术的建立1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组的DNA分子1973年美国斯坦福大学的Cohen等人，将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同时表现出两种抗性的细菌。Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相应的mRNA。3BergP、Cohen和Boyer等人的工作是世界上第一次实现DNA体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒—大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和产业——基因工程的诞生。基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景4基因工程的概念○基因工程是一种DNA重组技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状○基因工程的操作程序：获取目的基因——目的基因与载体构建重组DNA分子——重组DNA分子转移至受体细胞——转化细胞的扩增、鉴定和筛选5第二节工具酶一、限制性内切酶（一）分类与命名○酶有几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。○基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等水解酶分为内切酶和外切酶○内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。6限制性内切核酸酶(restrictionenzymes)能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。功能：降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染是细菌细胞为防御异源遗传物质进入的一种有效方式。7限制性内切酶分类第Ⅰ类限制性酶：每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列–识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)（EcoRⅠ）–另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(bluntends)8限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）9EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组10平齐末端（SmaⅠ）11限制性内切酶的命名属名＋种名＋菌株类型＋发现的顺序12限制性内切酶的主要用途○重组DNA分子·匹配末端的连接同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组DNA分子。·平端连接可直接连接，但效率较低。·不匹配黏端的连接先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接。○绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）13二、DNA聚合酶（一）DNA聚合酶的类型○依赖DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶。○不依赖DNA的——末端转移酶○依赖RNA的——反转录酶14DNA聚合酶的特性15三、DNA连接酶·该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’-P与另一也带相应缺口的DNA片段的3′-OH连接起来四、甲基化酶、核酸酶等（从略）16第三节基因工程载体○载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具○克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加○表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质○插入型载体——将外源基因或DNA插入其中○置换型载体——切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。17载体必须具备的条件·能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子·载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）·克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子·载体上要有报告基因或选择标记基因·在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点18一、质粒载体○质粒是一种存在于细菌细胞质中，独立于细菌染色体而自然存在的，在细菌体内能进行自我复制、易分离和导入的DNA环状双链分子○质粒大小相差很大（从小于1Kb到大于500Kb），都有一个复制起点。○亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定地共存，称为质粒的不亲和性。○只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范围质粒；可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿主范围质粒。19○严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有自身传递能力，分子量大。○松弛型质粒——每个细胞中有10-100个拷贝，不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用此类质粒。○常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。○质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。20第四节目的基因的获取○利用PCR克隆目的基因·反向PCR（inversePCR,I-PCR）克隆基因组DNA片段I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用的引物与正常的PCR引物方向相反·反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)合成cDNA·RT-PCR是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再复制成双链DNA21二、基因组文库的构建与基因克隆○基因组文库的概念·需要将某种生物全部基因组的遗传信息，儲存在可以长期保存的、稳定的重组体中，以便需要时即可应用。这种保存基因组信息的材料，称为基因文库。·当需要某一目的基因时，就可在基因组文库寻找，一般采用核酸探针的方法，从文库中“钓出”某基因。22○基因组文库的构建1．DNA片段的制备分离纯化基因组DNA——用限制酶完全酶切或部分酶切2．DNA片段与载体的连接选择合适的载体3．体外包装和基因组文库的扩增包装入噬菌体进行感染，或转化使质粒DNA进入细胞4．重组DNA的筛选和鉴定23三、基因的人工合成○如果已知某基因的核苷酸序列，或者通过基因产物的氨基酸序列推导出基因的核苷酸序列，就可将单核苷酸或寡核苷酸一个一个缩合起来，成为一个基因的核苷酸序列。连接的两个分子各有一端被封闭。○先合成分别属于双链序列的8-12碱基的片段，两个片段的对应部分配对后留有粘性末端，第三个片段再连接上去，不断延伸直至全部合成24第五节DNA体外重组和基因转移一、载体与基因的连接常用的连接方式有：粘性末端连接法、平头末端连接法、人工接头连接法、同聚物加尾连接法。（一）粘性末端连接法○相同限制酶切位点连接法同一的限制酶切割不同DNA会产生相同的粘性末端，在连接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二酯键而连接起来25（二）外源基因向真核细胞转入1．借助于载体的基因转移主要是以重组的动物病毒和逆转录病毒直接感染受体细胞，把外源DNA引入○逆转录病毒的特点：·病毒基因组为单链RNA，感染期间为双链DNA·DNA能整合进细胞并复制·DNA在动物通过生殖细胞传递到下一代；·带有对复制有重要意义的基因：gag（结构蛋白）、pol（DNA聚合酶）、env（被膜糖蛋白）262．不需载体的基因转移○磷酸钙沉淀法·细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力·将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐，生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中·由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞，DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核，整合到受体细胞的染色体上27○脂质体介导法·脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构·形成囊状结构可将DNA包在其中·带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的○血影细胞介导法·血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构·血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞○电转移法受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵）28第六节重组体的鉴定与筛选一、遗传检测法（一）抗体筛选法利用载体上的抗性基因对阳性克隆作初步的筛选。如pUC19质粒中有Ampr基因，为宿主细胞提供氨苄青霉素抗性。将转化后的细胞涂布在含氨苄青霉素的培养基中培养——·大部分受体细胞没有外源DNA导入，其本身又没有Ampr基因，所以在培养基中不能生长。·在含有外源DNA的受体细胞中，只有含有质粒自连或者质粒与目的DNA形成重组子的受体细胞由于含Ampr基因，能在培养基中生长。29（二）插入失活选择法·当外源DNA插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种现象称为插入失活。·例如，pBR322有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。·将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。30基因的插入失活效应31三、核酸分子鉴定法○Southernblot(Southern印迹试验)原理——利用硝酸纤维薄膜（或滤纸、尼龙膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝胶电泳，并将凝胶电泳的DNA区带吸附到膜上，然后在膜上进行同位素标记探针与被测样品只间的杂交，在通过放射自显影对杂交结果进行检测。32四、序列分析法测序分手工测序和自动测序。·手工测序有双脱氧测序法和化学测序法，前者广泛使用。·自动测序可用全自动化的DNA序列测序仪准确快速测定DNA序列。33○DNA自动测序·DNA自动测序仪根据Sanger的酶促反应原理，用4种荧光染料标记引物，这4种荧光在受到激光照射时会发出可以辩别的不同颜色。34二、转基因动物技术的主要步骤获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物35三、转基因动物的技术路线经典的技术路线目的基因显微注射已交配的取出移植受体动物妊娠供体动物受精卵输卵管转基因动物缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。36转基因动物的技术路线(续)整合胚胎移植的技术路线转基因动物受体动物子宫目的基因非手术胚胎移植体外受精体外培养多细胞胚胎检测整合外源基因卵子受精卵或囊胚的胚胎精子优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。37转基因动物的技术路线（续）核移植（克隆）的技术路线目的基因转基因动物导入动物胎儿成纤维细胞妊娠取核动物去核重组的体外培养囊胚期胚胎移植卵细胞受精卵胚胎受体动物子宫特点：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。38转基因动物的技术路线（续）整合卵受精的技术路线：目的基因转基因动物导入逆转录病毒妊娠精子感染体外受精胚胎移植卵母细胞成熟卵细胞囊胚受体动物子宫特点：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。39四、目的基因的制备和