豆粕中抗营养因子及其消除方法

豆粕中抗营养因子及其消除方法摘要：大豆是重要的植物蛋白质和油脂来源，具有极高的营养价值，在畜禽饲料中得到广泛应用。但大豆中的抗营养因子限制了大豆及其制品在畜禽饲料中的利用水平。因此，人们对大豆抗营养因子的钝化方法进行研究。本文简要地介绍了几种主要的大豆抗营养因子，并对使大豆抗营养因子失活的方法和发酵豆粕的营养特性进行了综述，为发酵豆粕在畜禽饲料中的广泛应用提供依据。关键词：发酵豆粕，大豆抗营养因子，钝化二十世纪九十年代以来，在英国疯牛病危机之后，引发了人们对畜禽饲料中动物来源蛋白质安全性的担忧，世界各国纷纷禁止动物源蛋白质在饲料中使用，由此相应地增加了对高质量植物蛋白的需求量。这意味着能够提供优质蛋白质的大豆和大豆蛋白制品必将在今后的畜禽饲料配制中扮演更加重要的角色。然而，大豆中含有的抗营养因子降低了养分的有效性，限制了其在动物饲料中的使用。因此，通过育种、加工和营养等手段来降低大豆及其制品中抗营养因子的含量，提高养分的利用率一直是营养学家们工作的重点。豆粕是大豆经浸提或预压浸提制油工艺的副产物，为植物性蛋白质饲料的主要来源之一，占畜禽蛋白质饲料原料用量的百分之六十以上。大豆榨油过程中的热处理可以有效地灭活大豆中的胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素等抗营养因子，但生产中对热处理必须进行严格控制：加热不足不能完全灭活抗营养因子，而加热过度，有可能因发生美拉德反应而降低养分的可利用率，使得豆粕的营养特性发生很大的变化（Helena等，2003），与传统的豆粕相比，发酵豆粕在营养成分含量、氨基酸有效性和抗营养因子去除率等方面均有很大提高。发酵豆粕是采用独特的菌种和发酵工艺，利用微生物发酵过程中分泌的蛋白酶使大豆蛋白被分解成小分子蛋白和小肽分子，游离氨基酸和UGF（未知生长因子）等物质，同时能消减抗营养因子的一些作用，使其易被幼龄动物消化吸收。因此，发酵豆粕作为功能性饲料蛋白质而受到广泛关注。大量的研究将发酵大豆蛋白和豆粕对于早期断奶仔猪的饲养效果进行比较（Cho等，2007），表明发酵过程中的酶解作用使发酵豆粕中含有较高比例的小肽（Hong等，2004）以及降低了发酵豆粕中的抗营养因子含量（Reddy和Pierson，1994）。但就目前来看，豆粕通过发酵工艺，微生物分泌蛋白酶降解蛋白的作用是否完全，抗营养因子被去除的程度，养分价值被提高的真实水平都有待探讨，所以进行动物饲养试验，并结合有效、全面的指标检测是必需的，关键是要采用简便、敏感度高的方法。1大豆的抗营养因子目前，人们把对营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质，统称为抗营养因子（antinutritionalfactors，ANFs）。人们很早就发现直接摄入豆科籽实会导致人和动物产生胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及一些不良生理反应的现象，这些生理反应是由大豆中含有的多种抗营养因子共同介导。从二十世纪初期，人们就开始了对大豆中抗营养因子的研究，并随着物理学、化学、免疫学、分子生物学等相关研究技术的发展逐步深入，成为动物营养研究的热点领域之一。多年来，人们对大豆中各种抗营养因子使动物产生的生理反应进行了大量研究，其效应会因抗营养因子的种类、含量以及动物的种类等的不同而有很大差异，见于表1.1。表1.1大豆中抗营养因子对动物的生理效应抗营养因子名称生理效应胰蛋白酶抑制因子降低胰（糜）蛋白酶活性，生长迟缓，胰腺增生、肿大大豆凝集素肠壁损伤，免疫反应，增加内源氮排出量，增加内源蛋白分泌抗原蛋白免疫反应，影响肠壁完整性单宁通过形成蛋白质－碳水化合物复合物，影响蛋白质和碳水化合物的消化皂甙溶血，影响肠道渗透性植酸磷与蛋白质和微量元素形成复合物，抑制微量元素的吸收大豆寡糖涨气、腹泻，影响养分消化异黄酮抑制生长，子宫增大抗维生素因子干扰动物对维生素的利用，引起维生素缺乏症引自：Liener，1994；李德发，2003。根据对饲料营养价值和动物生物学反应，将大豆中抗营养因子分为以下六类：（1）降低蛋白质消化率和利用率的因子（蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、凝集素等）；（2）降低碳水化合物消化率因子（酚类化合物如单宁和寡糖等）；（3）影响矿物质利用率的因子（植酸）；（4）影响维生素活性或增加动物维生素需求量的因子，包括抗维生素A、维生素D、维生素E和维生素B12等因子；（5）刺激免疫体系的因子（抗原蛋白）以及其它一些抗营养因子（致甲状腺肿因子、皂甙、异黄酮和生氰糖甙等）；（6）饲料中具有毒素作用的因子（凝集素）（李德发，2003)。1.1大豆蛋白酶抑制因子大豆蛋白酶抑制因子是指能和蛋白酶的必需基团发生化学反应，从而抑制蛋白酶与底物结合，使蛋白酶的活力下降甚至丧失的一类物质。通常所说的蛋白酶抑制因子是指蛋白质类胰蛋白酶抑制因子（trypsininhibitors，TI），按其结构组成可分为库尼兹大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitztrypsininhibitor，KTI）和包曼-伯克蛋白酶抑制因子（Bowman-Birkproteinaseinhibitor，BBI）两类，生大豆中含有1.4%的KTI和0.6%的BBI（李德发，2003）。其中KTI主要对胰蛋白酶有特异性的抑制。因此，KTI含量的高低在很大程度上决定了大豆所具有的抗营养作用的强弱。另外，非蛋白质类蛋白酶抑制因子不具有特异性，易失活，所以生理功能常被忽略。大豆蛋白酶抑制因子是大豆中的主要抗营养因子之一。采食含蛋白酶抑制因子的日粮后，畜禽的采食量、日增重和饲料转化率降低，但其影响程度受日粮中蛋白酶抑制因子浓度高低的影响。以雏鸡为例，当基础日粮中KTI的添加水平为2.37g/kg时，其日增重比对照组下降26.2%；当KTI添加水平达8.64g/kg时，生长速度下降56.2%（Han等，1991）。此外，对大豆蛋白酶抑制因子的耐受量与动物的种类、生理阶段（贺英等，1998；李素芬等，2000）、采用的饲喂方式以及饲喂时间等（李素芬等，2000）有关。1.1.1大豆蛋白酶抑制因子的测定研究因为科学家们对动物对蛋白酶抑制因子耐受量的深入研究以及蛋白酶抑制因子失活方法的发展，所以我们十分迫切地希望有一种方便、精确的测定方法。但是，这方面的研究比较薄弱（王冬燕，2003）。目前，实际生产中多以脲酶活性来判断大豆胰蛋白酶抑制因子的钝化程度，实验室采用的酶化学检测方法步骤繁琐、灵敏度低，而且测定加热过度产品时，结果变异较大，因此实际生产中很少采用。酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一种胰蛋白酶抑制因子的测定方法。这种方法灵敏度高、特异性强、准确性好、省时，但过程较复杂繁琐，需要专用的仪器设备。王冬艳（2003）以ELISA检测方法为基础，组装了大豆胰蛋白酶抑制因子（KTI）单克隆抗体免疫检测试剂盒，检测范围为0.01~10μg/mL。ELISA检测试剂盒的研制与推广应用，解决了酶联免疫吸附测定法部分操作繁琐的问题，使得一般条件的实验室和生产单位能够简便快捷地测定出大豆中胰蛋白酶抑制因子的含量，为大豆胰蛋白酶抑制因子（KTI）的研究以及饲料工业的质量检测提供前沿技术。1.2大豆凝集素Liener和Pallansch（1952）采用等电点盐析、移动界面电泳、超速离心沉淀技术结合红细胞凝集反应检测生物活性方法，从大豆提取物中分离出一种能凝集红细胞的蛋白质，并将其命名为大豆凝集素。其特点是能与糖结合，是具有生物活性的糖蛋白，能凝固红血球，因为植物凝集素与动物细胞上的特异糖基有很高的亲和力，不同动物细胞表面有不同类型的糖基，所以不同来源植物凝集素与不同种动物的细胞膜有特异性结合反应（徐晓峰和朱才，1996）。大豆凝集素与兔红细胞有特异性凝血反应，并使细胞凝集从悬浮液中析出，可根据凝血反应强度，用凝血效价表示含量。大豆凝集素的抗营养作用有：对动物生长有抑制作用，并随动物种类、生理阶段和饲喂量等而变化；影响营养物质的消化吸收，其中对氮代谢的影响比较明显，尿氮损失随着日粮凝集素水平的提高而明显增加；对小肠结构和功能有影响（李振田，2003）。1.2.1大豆凝集素的检测方法人们运用凝集素具有和红细胞凝集的特性，采用体外试管内红细胞凝集反应对凝集素进行观察和量化。同一种饲料样品对不同种类动物的红细胞凝集活性不同。不过因为红细胞来源对测定结果有重要影响，于是有学者提出一种不需要红细胞的方案，就是用与相应凝集素具有结合特异性的糖复合物共价连接与聚苯乙烯胶粒替代红细胞，其余步骤不变，这种方法较为简便。对于大豆凝集素来说，把N-乙酰基-半乳糖胺和乳糖共价连接于胶粒上，是最灵敏的凝集反应系统（潘洪彬等，2005）。1.3大豆寡糖大豆寡糖是大豆中含2~10个单糖基的低聚糖的总称，主要包括蔗糖、棉籽糖、水苏糖以及少量的毛蕊花糖。在自然界中，寡糖广泛存在于豆科植物中，但以大豆中的含量最高。大豆寡糖属于可溶性碳水化合物，一般占大豆固形物总量的7%~10%，其中蔗糖、棉籽糖和水苏糖各占5%、1%和4%，棉籽糖和水苏糖被视为难消化糖（李德发，2003）。人和动物摄入适量的大豆寡糖是有益的，能够促进肠道有益菌的增殖；起到防治便秘的作用。但这个剂量范围很小，一般认为大豆制品中的寡糖对单胃动物不利，引起胀气和腹泻。Zhang等（2003）报道，在玉米-奶粉型日粮中添加1%和2%水苏糖可显著降低断奶仔猪的增重速度，饲料转化有下降的趋势。1.3.1大豆寡糖的测定尽管有关寡糖的分析方法有报道，但传统的方法普遍存在分离效果差的问题。因此，张丽英等（2004）在实验室条件下建立了一个测定大豆及其产品中大豆寡糖（蔗糖、棉籽糖、水苏糖）气相色谱分析方法。本方法对测定大豆寡糖具有灵敏度高、简便和可靠及回收率高等特点，是研究大豆寡糖与动物营养素间关系的有效方法。周红等（2001）通过交联葡聚糖凝胶柱层析柱分离发酵液中寡糖，再用苯酚-硫酸法测定发酵液中的寡糖含量。分析测定结果可为发酵液的优化配制提供依据。1.4大豆抗原蛋白大豆中的抗原蛋白主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三种伴大豆球蛋白（α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin）。其中glycinin和β-conglycinin是大豆中免疫原性最强的两种抗原蛋白。四种大豆球蛋白均能引起断奶仔猪过敏反应，起主要作用的是glycinin和β-conglycinin。据报道，给7日龄仔猪灌服大豆蛋白提取液，每天6g，连续5d，21日龄断奶后，喂以含有相应大豆蛋白的断奶日粮，在血清中测出了较高效价的抗glycinin和β-conglycinin的抗体（Li等，1990）。研究还发现给仔猪灌服大豆蛋白引起猪的小肠绒毛萎缩，隐窝细胞增生，同时导致消化吸收障碍、生长受阻以及过敏性腹泻（谯仕彦等，1995；谯仕彦和李德发，1996）。孙鹏（2006）分析了蒸汽处理对纯化大豆抗原蛋白活性的影响。孙泽威等（2005）探讨了大豆抗原蛋白对犊牛生长性能、日粮养分消化率和肠道吸收功能的影响。以上研究表明，大豆抗原蛋白对畜禽生产性能会造成一定的影响。1.4.1大豆抗原蛋白的提取分离与测定李成贤等（2007）对大豆抗原蛋白的提取分离测定方法进行了综述。根据超速离心分析，用沉降系数S代表球蛋白组分(1S=10–13，S=1Svedberg单位)，可分为2S，7S，11S和15S四种成分，大豆蛋白主要是7S组分和11S组分，其中7S组分主要是β-conglycinin，而11S组分主要是glycinin。自1962年Wolf等人首先利用饱和硫酸铵分级的手段得到纯度为91%~93%的11S，球蛋白以来，根据抗原蛋白特性已建立了许多7S球蛋白和11S球蛋白分离及测定的方法，主要有:等电点沉淀法、冷沉淀法、盐析法、按离子强度不同而沉淀的分离法、免疫法（贾振宝等，2002；李德发，2003；彭楠等，2006）。1.5其他大豆抗营养因子与生物活性物质在大豆和大豆制品中除胰蛋白酶抑制因子、凝集素、寡糖、抗原蛋白外，还含有植酸、单宁、