分子生物学实验目录

1实验概述1.1实验目的实验过程中，主要通过碱裂解法提取质粒DNA、对质粒进行双酶切、并连接构建成重组DNA分子、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、感受态细胞的转化以及目的蛋白质gfp的正常表达，来完成一系列分子生物学基础实验。通过本实验，学习并掌握碱裂解法、双酶切、氯化钙法制备感受态细胞的制备及采用α互补现象进行重组DNA鉴定的原理和方法。1.2实验原理质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型，经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途。本次实验中，分子克隆质粒载体T所携带的外源基因是gfp绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将gfp基因插入表达载体P中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过HandⅢ和NCOⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段gfp和表达载体-P质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断gfp基因工程菌的构建效果。2实验流程2.1实验安排表实验内容时间安排质粒T、质粒P的提取3h电泳检测质粒提取效果30～45min确定质粒提取成功后，利用HindⅢ、NcoⅠ这2种限制性内切酶分别对质粒T、质粒P进行双酶切10～11h电泳检测酶切情况，若酶切成功，利用试剂盒回收DNA片断45min利用T4DNA连接酶进行连接14～16h大肠杆菌感受态细胞的制备3h转化（gfp基因导入受体细胞）2h重组子的筛选（在含有Amp的LB平板上筛选）12～16h诱导表达与鉴定（加入诱导物IPTG诱导gfp表达）12～16h2.2实验流程图①质粒DNA的提取与纯化碱液裂解法；乙醇洗涤纯化（T-gfp质粒作为克隆载体、P32作为表达载体）②通过观察电泳图片，来鉴定T、P两种质粒DNA的提取结果琼脂糖凝胶电泳的方法③对成功提取的T、P两种质粒DNA进行双酶切限制性内切酶HandⅢ、NcoⅠ④T-gfp、P两种质粒的DNA片段的回收割胶（试剂盒快速回收）用刀片把凝胶上的目的DNA条带割取下来⑤连接T-gfp、P两种质粒的目的DNAT4噬菌体DNA连接酶（重组DNA分子的构建）⑥大肠杆菌感受态细胞的制备氯化钙法⑦将连接后的重组DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞感受态细胞的转化⑧重组子的筛选含有AMPr的重组子才能在AMP平板上生长⑨将含有gfp、AMPr两种目的基因的重组子进行诱导表达重组DNA分子的鉴定在平板上加入底物IPTG⑩gfp基因只有在诱导物IPTG和底物X-gal的存在时，才能正常表达，在平板上生成绿色的菌落构建出含有gfp绿色荧光蛋白基因的工程菌图2.1gfp基因工程菌的构建与表达gfp绿色荧光蛋白基因被诱导表达3实验操作方法3.1质粒DNA的提取3.1.1实验概述1、分子克隆载体载体是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。在本次实验中，我们所选择的克隆载体是大肠杆菌T-gfp质粒。细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。目前，质粒已成为最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。有许多方法可用于质粒DNA的提取，本次实验采用碱裂解法来提取T质粒的DNA。2、表达载体将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.coli表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中在本次实验中，我们所选择的表达载体是大肠杆菌PBR322质粒。3、绿色荧光蛋白（GFP）greenfluorescentprotein，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reportergene)。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。3.1.2实验目的1、通过用LB培养液培养含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌。2、利用“碱裂解法”从大肠杆菌中提取出T质粒和P质粒的DNA，然后用乙醇洗涤沉淀，达到纯化质粒DNA的目的。3.1.3实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法，通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，可经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤来纯化质粒DNA，故在分子生物学实验室中常用。所以，在本次实验中，我们采用了“乙醇沉淀法”来洗涤DNA沉淀物，去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求。3.1.4实验仪器、材料及试剂1、仪器微量移液枪、微量离心管、台式高速离心机、干燥机、高压蒸汽灭菌锅、常用玻璃器皿等。2、材料含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌DH5∂。T质粒和P质粒的图示如下：（1）T-gfp质粒（扩增载体）图3.1T-gfp质粒载体（2）PBR322质粒（表达载体）应用的最广泛的质粒载体是PBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。其基本结构如图所示：图3.2PBR322质粒载体3、试剂（1）用于碱法提取质粒DNA的三种溶液表3.1碱法提取质粒DNA的三种溶液（2）缓冲液TE缓冲液：10mmol/LTri-HCl，1mmol/LEDTA（pH=8.0），其中含有RNase20μg/L。（3）其他试剂氨苄青霉素(AMP)，异丙醇，70﹪乙醇溶液，RNase液。3.1.5操作步骤1、培养大肠杆菌使质粒扩增（1）配制LB液体培养基将下列组分溶解到0.9L水中，让后再将水补足至1L：表3.2LB液体培养基配方成分含量蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g1mol/LNaOH调整至pH=7.01L的LB培养液配制好之后，分别分装到4个三角瓶中，250mL/个。然后放置到高压蒸汽灭菌锅中灭菌1.5～2h。灭菌后取出移至超净工作台，冷却到47℃左右，每瓶培养液分别加入5μL的氨苄青霉素（AMP）。（2）培养大肠杆菌将带有质粒T-gfp和PBR322的大肠杆菌单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基2～5mL中，然后放置在恒温37℃的摇床中培养8～16h。试剂名称试剂成分及含量溶液Ⅰ(GET缓冲液)50mmol/L葡萄糖，10mmo/LEDTA，25mmol/LTri-HCl（pH=8.0），用前加溶菌酶4mg/mL溶液Ⅱ（变性液）0.2mol/LNaOH，1﹪SDS溶液Ⅲ（乙酸钾溶液）60mL的5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O加入AMP的目的：AMP可以抑制宿主的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可以继续复制，若干小时后，拷贝数持续递增。2、收集和裂解大肠杆菌（1）取含有质粒T、P的大肠杆菌液体培养液1.5mL分别装于微型离心管中，转速10000转/min离心1min，去掉上清液，加入1μL溶液Ⅰ，充分混匀后室温下放置5min。溶液Ⅰ的作用：所含有的EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和抑制微生物生长，加入EDTA可以把大肠杆菌细胞中所有的二价金属离子都螯合掉。（2）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，颠倒2～3次使之混匀，冰上放置5min。溶液Ⅱ的作用：十二烷基酸钠（SDS）可以使细胞壁破裂。经SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都会发生变性。注意：一是操作时间不能过长，因为在此碱性条件下染色体DNA片段会慢慢断裂；二是操作时动作要温和，振荡激烈也使染色体DNA片段断裂。（3）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，轻轻颠倒数次使之缠绕均匀，冰上放置5min。实验现象及溶液Ⅲ的作用：溶液Ⅲ加入后，我们可以观察到离心管内出现白色沉淀。KAc中的K离子把SDS中的Na离子置换出来从而形成了不溶性的PDS，由于K离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质也沉淀下来，同时大肠杆菌的染色体DNA也一起被共沉淀了。醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，一旦发生断裂，染色体DNA就不可能被共沉淀了。此时，质粒DNA很快可以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可以得到质粒DNA。3、分离和纯化质粒DNA（1）用台式高速离心机，转速10000转/min离心5min，将上清液移入另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇混匀，室温放置5min，转速12000转/min离心5～8min，弃去上清液。（2）沉淀用70﹪乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。加入异丙醇和乙醇的作用：因为有部分蛋白质还未被沉淀出来，所以要用异丙醇进行抽提，然后进行乙醇沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为掺入DNase而发生降解。加入异丙醇后，溶液界面的分层就会更清晰，便于沉淀的回收。回收后的沉淀因为可能含有一定的盐类，因此要加入乙醇洗涤沉淀，将盐去除。（3）每支离心管加入3μLRNase和30μL无菌水，然后室温放置10min，使质粒DNA充分溶解。加入RNase的作用：使样品中残留的、未降解的RNA降解，避免干扰电泳鉴定的结果。3.1.6实验结果得到分别含有T-gfp质粒和P质粒的