生物技术制药第五章--动物细胞制药

第五章动物细胞制药第一节概述1665年英国物理学家虎克(Hooke)用自制的显微镜发现了细胞，实际上是死细胞留下的细胞壁，不久，荷兰科学家列文虎克(Leeuwenhoek)才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元，并创立了细胞学说细胞学说的创立细胞虽小（直径约10μｍ），但其结构复杂而精细，分工明确，并且具有巨大的生产能力，于是出现了组织或细胞培养组织或细胞培养组织培养或细胞培养是将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发展，逐渐形成了细胞工程学1.概念：以细胞为单位，（按人们的意志）应用生物学、分子生物学等理论和技术，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品2.方法：真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及将有关产物提取纯化的理论和技术细胞工程第二节动物细胞的形态和生理特点一、动物细胞的形态动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，为了适应各自的功能，细胞特化成不同的形态如神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激红细胞呈扁圆盘状，增大其接触面肌肉细胞成纺锤形，满足伸展收缩的需要等但细胞在离体培养条件下，有时形态也会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为两类贴壁依赖型（贴壁细胞）贴壁非依赖型（悬浮细胞）1.贴壁细胞生长时必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖，细胞在表面上生长时有两种形态成纤维样细胞型：主要来源于中胚层组织细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞等上皮样细胞型：主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，如皮肤细胞、肠管上皮细胞在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变2.悬浮细胞细胞的生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。3.兼性贴壁细胞细胞根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，如中国地鼠卵巢细胞二、动物细胞生理特点1.分裂期长一般12-48h，同一种属不同部位的细胞也不相同，分裂期受培养条件的影响（如温度、酸度、成分等）2.细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长繁殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时（即细胞与周围细胞接触时），细胞就停止增殖——接触抑制，若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除3.正常二倍体细胞的寿命有限正常二倍体细胞传代培养都是有限的，大约50代左右，然后细胞就会逐渐死亡，但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，更适合于工业生产4.动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感5.动物细胞对培养基要求很高原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子6.动物细胞中蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物细胞蛋白质的合成在游离核糖体及与糙面型内质网结合的核糖体上都可以进行，内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程所以动物细胞在生产活性蛋白是较原核细胞更有优势优点：产物多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用缺点：培养周期长、条件要求高、成本高、产量低三、动物细胞作为宿主生产药物的优、缺点第三节生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞，以后放宽至二倍体细胞即可，即使是经过多次传代也可用，但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的（因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体，有致癌的危险）但是，由于二倍体细胞传代不会超过50代，所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用，并未对机体产生影响，并且可无限使用，对工业生产带来了极大的方便原代细胞已建立的二倍体细胞系可无限传代的转化细胞系二、生产用动物细胞的获得1.原代细胞直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液缺点：需大量动物，费钱费劳力2.二倍体细胞原代细胞经过传代、筛选和克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株特点：二倍体；有明显的贴壁和接触抑制特性；有限的增殖能力；无致瘤性3.转化细胞系通过转化形成，变成了异倍体(如甲基胆蒽)，具有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系优点：无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低，适合于大规模工业化生产三、常用生产用动物细胞的特性WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-46代，用于制备疫苗CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于构建工程菌BHK-21：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗Vero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细胞，用于制备疫苗Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体四、基因工程细胞的构建和筛选生产中常采用融合细胞或基因工程构建的工程菌1.真核细胞基因表达载体的构建（1）病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒等牛痘病毒已广泛用于构建多价疫苗；逆转录病毒正被试验用于基因治疗；杆状病毒载体-昆虫细胞体系也已成功用于几百种外源基因的高效表达用杆状病毒作载体的优点①该病毒基因是双链的,容易进行重组②插入7-8千碱基对不影响正常病毒的形成③可用外源基因更换部分病毒基因，仍具有感染力④有很强的启动子⑤用光学显微镜可见，容易挑选阳性克隆⑥可直接表达外源基因构建穿梭质粒载体应具有的基本成分①允许载体在细胞内扩增的质粒序列②含有能使基因转录表达调控元件③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统（2）质粒载体2.基因载体的导入和高效表达工程细胞的筛选方法：融合法、化学法、物理法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法磷酸钙沉淀法：将溶解的DNA加在NaH2PO4溶液中，再逐渐加入CaCl2溶液，当NaH2PO4和CaCl2形成Ca3PO4沉淀时，DNA被包裹在当中，形成DNA-Ca3PO4共沉淀。当沉淀物与细胞表面接触时，通过细胞吞噬作用将DNA导入其中。优点是方法简单、可进行共转化，可将不含选择性标记的DNA和含选择性标记的DNA放在一起进行形成混合的共沉淀物，一起导入细胞。电穿孔法:借助电穿孔仪（电转仪）产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA即可进入细胞。转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低依靠构建载体内的选择性标记采用相应的筛选系统：如：HAT、GPT、G418、MTX筛选相应的转化细胞；对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化五、细胞库的建立除原代细胞外，其他细胞株、细胞系，包括二倍体、转化细胞、融合细胞和工程细胞都需建立细胞库保存用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库，原始细胞库和生产用细胞库(或称工作细胞库)原始细胞库应有详细档案:1.该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料2.该细胞的特性：形态、生长特性3.对各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体和各种病毒生产用细胞库的细胞来源于原始细胞库，然后经扩增达一定数量后，再分装形成细胞库第四节动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞在体外培养所需条件1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染2.必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免有害离子掺入3.保证有适量的氧气供应4.需随时清除细胞代谢中的有害产物5.有良好的适于生存的外界环境，如pH值、渗透压、离子浓度等6.及时分种，保持合适的细胞密度二、动物细胞的培养条件1.器材的清洗（如器材上残留的物质和油污会影响细胞的贴壁）一般需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四步清洗过程2.器材的消毒灭菌（表5-4）3.水质（如微量的有毒元素、过量的金属离子等）4.pH值应在7.2~7.4；高于7.6或低于6.8都会影响细胞生长5.渗透压一般通过增减NaCl的方法调节渗透压6.温度动物细胞（特别是哺乳动物细胞）最佳培养温度37±0.5℃；昆虫细胞应为27℃7.空气通过搅拌等方法使培养液溶入适量氧三、动物培养基的种类和组成天然培养基合成培养基无血清培养基1.天然培养基有血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水由于该类培养基成分复杂，组分不稳定，来源有限，因此不适合大量培养和生产的需要组成稳定、可大量生产供应。成分为氨基酸（细胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、其他（前体和氧化还原剂）合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加5%-10%的小牛血清，才能使细胞很好地增殖添加小牛血清的作用：①提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素②提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子③提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素2.合成培养基（表5-7）3.无血清培养基优点：①提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险③供应充足、稳定④细胞产品易于纯化⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素第五节动物细胞培养方式和操作方式一、动物细胞的大规模培养方法（一）培养方法分类1.根据培养细胞可分为：原代细胞培养和传代细胞培养2.根据培养容器和方式可分为：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养3.实际生产可分为：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养1.悬浮培养适用条件：非贴壁依赖性细胞优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式2.贴壁培养适用条件：贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，使细胞达到高密度缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差（二）培养方法3.贴壁-悬浮培养（1）微载体培养优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长（2）包埋和微囊培养优点：①包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害②可以获得较高的细胞密度③通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理④可采用多种生物反应器进行大规模培养（3）结团培养（利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养）优点：操作简单、节省微载体用量二、动物细胞培养的操作方式分批、半连续、灌流式培养见细胞工程和发酵工程的相关内容第七节动物细胞制药的实例组织纤溶酶原激活剂生产工艺组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，它纤溶酶原亲和力低，而与纤维蛋白亲和力较大，将纤溶酶原与纤维蛋白结合形成的复合物后，可提高其与tPA的亲和力，