免疫印迹法

Westernblot原理与相关技术操作主要内容Westernblot一般流程Westernblot常见问题分析Westernblot简介Westernblot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Westernblot的中文名称是：蛋白质印迹,也叫免疫印迹（immunoblotting)。是分子生物学中常用的三种印迹技术之一。目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。Westernblot——蛋白质印迹Southernblot——DNA印迹Northernblot——RNA印迹Westernblot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白Westernblot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析主要内容Westernblot简介Westernblot一般流程Westernblot常见问题分析6.最后加上相应的底物溶液，当二抗上的酶催化底物产生化学发光时,用X光片曝光，洗片后就会产生可见的区带，指示目的蛋白质的位置和强弱。3.通过SDS-PAGE电泳将蛋白样品分开。5.印迹首先用封闭液（如5％的脱脂奶粉）处理以封闭固相载体上剩余的疏水结合位点，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印迹中只有目的蛋白质与一抗特异性结合。洗去游离的一抗后，用再与酶标记的二抗孵育4.将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持体.转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。1.样品前处理，提取细胞或组织蛋白2.测定蛋白浓度，样品变性Westernblot流程一、蛋白样品的提取提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多，鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此裂解方法有所不同。不论采用那种方法，都应遵循以下原则：1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求RIPA裂解液（中度）配方：1MTris-HCl(pH7.4)2ml3MNaCl(MW:58.5)2mlNP400.4ml0.5MEDTA0.04ml5%脱氧胆酸钠4ml18兆去离子水调整总体积40ml①50mMTris-HCl(pH7.4)②150mMNaCl③1%NP40④0.5%脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)⑤0.5mMEDTA每10mlRIPA裂解液放入0.1ml蛋白酶抑制剂cocktail.-20℃分装保存，临用前无需加入PMSF。二、蛋白样品的定量Westernblot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组之间总蛋白量基本一致;蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。BCA法蛋白浓度测定原理：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuretreaction），一价铜离子和独特的BCASolutionA（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。试剂：BCA工作液，双蒸水，蛋白标准液（将2mg/ml蛋白溶液稀释至2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,0.0625mg/ml。）管号012345蛋白标准液100502512.56.253.125ddH2O0507587.593.596.8样品101010101010BCA(ML)222222xaxis00.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.20.40.60.81Graph#1LinearFit:y=A+Bx:ABR^2Plot#1(Group01:ConcentrationvsValues)0.03341.010.997三、蛋白样品的变性2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚兰20%甘油ddH2OSDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。四、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶配制及蛋白分离范围5ml10%分离胶3ml5%浓缩胶ddH2O1.92.130%Acr1.70.5PH8.8Tris1.3PH6.8Tris0.3820%SDS0.0250.01510%AP0.050.03TEMED0.0020.003作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212灌胶灌制分离胶隔绝空气灌制浓缩胶插入梳子电泳加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品（Marker：5-10l；样本：10l）。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。采用恒压的方法：1.恒压60V，至样本跑过浓缩胶；2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行进行转膜。StakinggelSeparatinggel五、转膜凝胶电泳结束后，将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。选择膜的主要根据有：1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量）2.膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）3.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法，信噪比好）4.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜转移膜的选择湿转系统转一张膜需准备滤纸和1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化15-20min（其中PVDF膜需在无水甲醇中活化30min后再浸润于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极，按照三层滤纸凝胶转印膜三层滤纸的顺序制成“三明治”（湿转在三明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡）。-滤纸凝胶膜滤纸+蛋白质印迹转移示意图电转仪极极转移方向转移液转移液三层滤纸转膜夹板NC膜半干转移系统转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。将凝胶用考马斯亮蓝染色，观察凝胶中的蛋白是否完全转至印迹膜上。六、转膜后检测SubstrateProteinProteinBlockingAgentBlockingAgentBlockingAgentMembranePrimaryAntibodySecondaryAntibody/Enzyme(E)EEsssssssssProductPPPPP七、封闭，结合一抗，结合二抗封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。结合一抗、二抗把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。八、固相免疫检测利用ECL（增强化学发光）发光检测目的蛋白。ECL试剂采用氧化还原反应的原理：发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。九、Westernblot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。内参的选择内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。内参起着校正总蛋白上样量的重要作用，只有在内参条带基本均匀一致的情况下，目的蛋白条带出现的差异才有意义,表明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化，而不是加样误差造成目的条带含量的变化。内参名称分子量大小适用范围Tubulin55kD胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kD线粒体COXIV16kD线粒体LaminB166kD细胞核TBP38kD细胞核β-actin42kD胞浆GAPDH35kD胞浆主要内容Westernblot简介Westernblot一般流程Westernblot常见问题分析SDS-PAGE电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS-PAGE电泳杂交信号很弱1.抗体保存不当2.抗原不充足3.膜的漂洗过度原因对策1.抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数1.一抗不是唯一特异的2.二抗出现非特异结合原因对策1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带1细胞中不表达这种蛋白质2细胞中的蛋白质被降解3转膜过程出现失误；4抗体或酶失活原因对策1.换一种细胞2.必需加入PMSF或其他蛋